小分子和蛋白质相互作用实验

　　研究小分子与蛋白质相互作用是药物发现、化学生物学和功能机制研究的核心环节。根据实验目的(亲和力、结合位点、功能影响等)，可选择多种互补技术。

　　主流体外结合实验方法

　　1. 表面等离子共振(SPR)

　　原理：小分子流过固定在芯片上的蛋白，实时监测结合引起的折射率变化。

　　优点：

　　无需标记小分子;

　　提供 konkon​ 、 koffkoff​ 、 KDKD​ ;

　　可测弱结合(μM–mM)。

　　局限：

　　蛋白需固定，可能失活;

　　小分子 MW <100 Da 时信号弱(<50 RU)。

　　样品需求：

　　蛋白：≥50 μg(纯度 >90%);

　　小分子：≥1 mg(溶解度 >1 mM)。

　　适用：中高通量筛选、先导化合物优化。

　　技巧：用 捕获法(如 His-tag + NTA 芯片)代替共价偶联，保持蛋白活性。

　　2. 等温滴定量热法(ITC)

　　原理：直接测量小分子滴定到蛋白溶液中释放/吸收的热量。

　　优点：

　　金标准，无需标记;

　　同时获得 KDKD​ 、 ΔHΔH 、 ΔSΔS 、化学计量比 nn ;

　　溶液相，接近生理状态。

　　局限：

　　蛋白消耗大(0.3–1 mg/次);

　　要求 ΔHΔH 显著(非熵驱动结合难测);

　　不适用于弱结合( KD>100 μMKD​>100 μM )。

　　适用：机制研究、高价值靶点验证。

　　3. 微量热泳(MST)

　　原理：红外激光加热局部区域，荧光标记蛋白因结合小分子而热泳行为改变。

　　优点：

　　样品消耗极低(蛋白 <1 μg);

　　耐受复杂缓冲液(血清、细胞裂解液);

　　KDKD​ 范围广(pM–mM)。

　　局限：

　　需荧光标记蛋白(或利用色氨酸自发荧光);

　　小分子需无强荧光/吸光干扰。

　　适用：珍贵蛋白、膜蛋白、初筛。

　　4. 差示扫描荧光法(DSF / Thermal Shift)

　　原理：小分子结合提高蛋白热稳定性，熔解温度( TmTm​ )升高。

　　优点：

　　超低成本、高通量(96/384 孔板);

　　仅需普通 qPCR 仪;

　　快速初筛(1 天可测 1000+ 化合物)。

　　局限：

　　仅间接证明结合;

　　假阳性(如沉淀剂提高 TmTm​ );

　　不提供 KDKD​ 。

　　染料选择：

　　SYPRO Orange(通用);

　　NanoDSS(免染料， intrinsic fluorescence)。

　　适用：苗头化合物筛选、结合条件优化。

　　5. 荧光偏振(FP) / 时间分辨荧光(TR-FRET)

　　原理：小分子标记荧光，结合大分子后旋转变慢，偏振信号增强。

　　优点：

　　均相检测，适合高通量;

　　可用于竞争实验(测 IC₅₀ → KiKi​ )。

　　局限：

　　需合成荧光标记小分子探针;

　　背景干扰(如化合物自身荧光)。

　　适用：已知靶点的高通量筛选(HTS)。

       来源：网络