16S rRNA 微生物多样性测定测序完整流程

　　微生物多样性测定是研究环境、人体或工业样本中微生物群落组成、结构与功能潜力的核心手段，广泛应用于肠道菌群、土壤生态、水体污染、发酵工艺、临床感染等领域。目前主流方法已从传统培养法全面转向高通量测序技术。

　　16S rRNA 测序完整流程

　　步骤1：样本采集与保存

　　样本类型：粪便、土壤、水体、口腔拭子、发酵液等

　　保存：立即冻存于 –80℃，或使用 DNA/RNA 保护剂(如 RNAlater)

　　步骤2：DNA 提取

　　使用专用试剂盒(如 QIAamp PowerFecal Pro, MO BIO)

　　关键：高效破壁(针对革兰氏阳性菌、孢子)

　　质控：Nanodrop(A260/A280≈1.8)、Qubit(浓度)、电泳(完整性)

　　步骤3：PCR 扩增与建库

　　引物选择：

　　细菌/古菌：515F (GTGYCAGCMGCCGCGGTAA) + 806R (GGACTACNVGGGTWTCTAAT)

　　真菌(ITS)：ITS1F + ITS2

　　加接头与barcode：实现多样本混合测序(multiplexing)

　　步骤4：高通量测序

　　平台：Illumina MiSeq(2×300 bp)或 NovaSeq

　　数据量：≥50,000 reads/样本(肠道)，≥100,000(土壤)

       来源：网络