蛋白与rna体外结合实验方法

　　蛋白与 RNA 的体外结合实验是研究转录后调控、RNA 代谢、相分离、抗病毒机制等关键生物学过程的核心手段。下面介绍主流实验方法，涵盖原理、操作要点、适用场景及注意事项。

　　详细方法

　　1. EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)

　　原理

　　蛋白与 RNA 形成复合物 → 分子量增大 → 在非变性 PAGE 中迁移变慢

　　游离 RNA 与复合物分离，通过放射性/荧光显影检测

　　操作要点

　　RNA 标记：

　　5′-end labeling(T4 PNK + [γ-³²P]ATP)

　　或荧光标记(Cy5-UTP 体外转录)

　　结合反应：

　　缓冲液：含 10 mM HEPES (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL tRNA, 5% 甘油

　　加 RNase 抑制剂(如 RNasin)

　　室温孵育 20–30 min

　　电泳：

　　4–8% 非变性 PAGE，4°C，低电压(避免复合物解离)

　　注意事项

　　特异性验证：

　　冷竞争：加 100× 未标记 RNA

　　突变 RNA：关键序列突变应消除结合

　　超迁移(Supershift)：加抗体确认蛋白身份

　　适用：快速验证结合、筛选 RNA 结合域(RBD)

　　2. Filter Binding Assay

　　原理

　　硝酸纤维素膜(NC)结合蛋白及蛋白-RNA 复合物，但不结合游离 RNA

　　DEAE 膜可结合游离 RNA(用于校正)

　　操作流程

　　蛋白 + ³²P-RNA 梯度浓度混合

　　点样到 NC 膜

　　快速真空抽滤

　　洗膜 → 测放射性 → 计算结合比例 → 拟合 KdKd​优点

　　直接在溶液中反应，接近生理状态

　　可测弱亲和力( KdKd​ up to μM)

　　缺点

　　需放射性同位素

　　通量极低(手工点样)

　　3. SPR(Surface Plasmon Resonance)

　　RNA 固定策略(关键!)

　　推荐方案：反向固定(Capture Coupling)

　　固定抗 His-tag 抗体

　　捕获 His-tag 蛋白

　　注入 RNA → 测结合

　　优势：避免 RNA 固定导致的结构破坏

　　注意事项

　　RNA 需 HPLC 纯化，避免降解

　　缓冲液加 0.005% Tween-20 + RNase 抑制剂

　　再生条件温和(如 10 mM glycine pH 7.5)

　　4. MST(MicroScale Thermophoresis)

　　标记选择

　　标记 RNA：5′-Cy5 / 6-FAM(推荐，避免蛋白功能干扰)

　　标记蛋白：NT-647 NHS 酯(需验证不影响 RNA 结合)

　　实验设计

　　固定荧光 RNA(1–10 nM)

　　滴定蛋白(16 点，覆盖 0.1×–100× KdKd​ )

　　缓冲液：含 0.05% Tween-20, 1 mM DTT, RNase 抑制剂

　　优势

　　可在含 tRNA/细胞裂解液中测(模拟生理环境)

　　样品仅需 4 μL × 16 = 64 μL

　　5. ITC(Isothermal Titration Calorimetry)

　　适用条件

　　蛋白浓度 ≥ 10 μM

　　RNA 高纯度(OD₂₆₀/₂₈₀ > 2.0)

　　结合放热明显( ΔHΔH > 1 kcal/mol)

　　注意事项

　　RNA 易吸附管壁 → 使用低吸附管

　　缓冲液匹配：避免质子交换热干扰(推荐磷酸盐缓冲液)

　　预实验：先用 EMSA 确认结合，再投入 ITC

       来源：网络