游离氨基酸测定方法有哪些？

　　游离氨基酸(Free Amino Acids, FAAs)是指未参与蛋白质合成、以游离形式存在于细胞或体液中的氨基酸，广泛参与代谢调节、渗透压平衡、风味形成、神经信号传导及营养评估。其测定在食品科学、临床诊断、植物生理、微生物发酵等领域具有重要意义。

　　由于游离氨基酸无强发色团、极性高、结构相似，需通过衍生化或高灵敏检测技术实现准确定量。以下是主流测定方法的系统对比与操作指南。

　　主流方法详解

　　1. HPLC 荧光检测(AccQ-Tag 法，Waters 推荐)

　　原理：

　　氨基酸与 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)反应，生成稳定荧光衍生物(Ex/Em = 250/395 nm)。

　　流程：

　　样品前处理：

　　组织：匀浆 → 80% 乙醇沉淀蛋白 → 离心取上清;

　　血清/尿液：去蛋白(磺基水杨酸或超滤);

　　植物汁液：稀释 + 过滤(0.22 μm)。

　　衍生化：

　　样品 + 硼酸盐缓冲液 + AQC 试剂 → 55℃ 反应 10 min;

　　UPLC 分离：

　　色谱柱：BEH C18(1.7 μm, 2.1×100 mm);

　　流动相：A=0.1% 甲酸水，B=乙腈;

　　梯度洗脱，20 min 内分离 20+ 种氨基酸。

　　优点：

　　衍生快速、稳定;

　　脯氨酸、甘氨酸等均能良好检测;

　　适用于复杂基质(如牛奶、发酵液)。

　　2. UPLC-MS/MS(无衍生或简单衍生)

　　优势：

　　无需衍生，避免副反应;

　　多反应监测(MRM)模式，抗干扰强;

　　可同时定量氨基酸及其同位素标记物(代谢流研究)。

　　典型条件：

　　色谱柱：HILIC(亲水作用色谱)，如 XBridge Amide;

　　流动相：乙腈/水 + 0.1% 甲酸;

　　内标：D3-亮氨酸、13C5-谷氨酰胺等;

　　检出限：0.01–0.1 μM。

　　适用场景：

　　临床血浆氨基酸谱(遗传代谢病筛查);

　　植物胁迫响应(脯氨酸积累);

　　微生物发酵液动态监测。

　　3. 氨基酸分析仪(离子交换 + 茚三酮柱后衍生)

　　国标方法：

　　GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》

　　AOAC 994.12

　　原理：

　　样品经磺基水杨酸去蛋白;

　　离子交换色谱分离;

　　茚三酮(ninhydrin)柱后反应 → 570 nm(α-氨基酸)、440 nm(亚氨基酸如脯氨酸)检测。

　　特点：

　　无需内标，外标法定量;

　　可测牛磺酸、γ-氨基丁酸(GABA)等非蛋白氨基酸;

　　缺点：分析时间长(>60 min)，高温反应可能降解部分氨基酸。

       来源：网络