微量热泳动mst浓度梯度实验步骤

　　MST(MicroScale Thermophoresis，微量热泳动) 是一种高灵敏、低样品消耗的分子互作分析技术，通过检测分子在温度梯度下的定向移动(热泳)变化来定量亲和力(KD)。其核心实验设计是 “固定配体浓度 + 梯度稀释分析物” 的浓度梯度实验。

　　下面是 MST 浓度梯度实验操作方法：

　　实验操作流程(以 NanoTemper Monolith 为例)

　　步骤 1：样品准备

　　标记配体：

　　使用 NHS-染料(如 NT-647)共价标记蛋白

　　或使用 His/GST 标签 + 荧光抗体(免纯化)

　　缓冲液匹配：

　　所有样品用相同缓冲液(建议含 0.05% Tween-20 减少吸附)

　　分析物用缓冲液 16 点 1:1 稀释(如 1 mM → 0.5 mM → … → 30.5 pM)

　　混合：

　　各浓度分析物 + 固定浓度配体(如 10 nM)

　　室温孵育 5–10 分钟(确保平衡)

　　步骤 2：上机检测

　　加样至 Premium Capillaries(毛细管)

　　选择 “Thermophoresis + T-Jump” 模式(提高信噪比)

　　设置：

　　MST power: 40–80%(避免气泡)

　　LED power: 自动或手动优化(荧光不过曝)

　　步骤 3：重复性

　　每个浓度做 2–3 次技术重复

　　至少 2 次独立生物重复

       来源：网络