蛋白与蛋白直接结合的实验

　　要确证两个蛋白之间存在直接的物理结合(即不依赖其他分子如第三蛋白、DNA、RNA 或辅因子的介导)，必须采用体外(in vitro)的实验策略。

　　金标准方法(推荐优先使用)

　　1. 表面等离子共振(SPR)

　　原理：将一个蛋白固定在传感器芯片上，另一个流过，实时监测结合引起的折射率变化。

　　输出：动力学参数(kon, koff)、亲和力(KD)。

　　优势：无标记、实时、定量、高灵敏(pM–μM)。

　　关键对照：

　　空白芯片;

　　标签蛋白 alone(如 GST);

　　结合位点突变体。

　　设备：Biacore™(Cytiva)、OpenSPR。

　　示例：若野生型 KD = 50 nM，突变体无结合 → 强直接相互作用证据。

　　2. 等温滴定量热法(ITC)

　　原理：将一种蛋白滴入另一种蛋白溶液，直接测量结合热。

　　输出：KD、化学计量比(n)、ΔH、ΔS、ΔG。

　　优势：完全无标记、无固定，提供完整热力学信息。

　　局限：蛋白消耗量大(>20 μg)，KD 范围限于 10 nM – 100 μM。

　　设备：MicroCal PEAQ-ITC(Malvern)。

　　适用场景：验证结合是焓驱动(特异性高)还是熵驱动(疏水主导)。

　　3. 体外 Pull-down(使用纯化重组蛋白)

　　流程：

　　纯化 Protein A-GST;

　　固定于 Glutathione 树脂;

　　加入纯化的 Protein B(无标签);

　　洗脱后 WB 检测 Protein B。

　　必须对照：

　　GST alone + Protein B(阴性);

　　Input(确认 Protein B 存在)。

　　优点：成本低、直观;

　　关键：Protein B 必须体外纯化，不能来自细胞裂解液!

       来源：网络