抗原抗体亲和力方法详解与操作要点

　　抗原-抗体亲和力(Affinity)是衡量两者结合强度的核心参数，通常用平衡解离常数(KD) 表示：

　　KD = koff / kon(单位：M)，KD 越小，亲和力越高(如 1 nM 比 1 μM 亲和力高 1000 倍)。

　　各方法详解与操作要点

　　1. SPR(金标准)

　　固定策略：

　　抗体固定(常用 Protein A/G 芯片)→ 注入抗原(避免抗原失活)

　　或抗原固定(胺偶联/标签捕获)→ 注入抗体

　　关键参数：

　　流速：30–100 μL/min

　　再生条件：筛选温和再生液(如 10 mM Glycine pH 1.5–3.0)

　　优势：实时、无标记、高灵敏度、可测弱/强亲和力

　　案例：单抗 KD = 0.5 nM，kon = 2×10⁵ M⁻¹s⁻¹，koff = 1×10⁻⁴ s⁻¹(半衰期 t1/2 ≈ 2 小时)

　　2. BLI(操作简便，适合粗样品)

　　传感器 tip 类型：

　　Protein A：直接捕获 IgG 抗体(Fc 段)

　　Streptavidin (SA)：固定生物素化抗原

　　步骤：

　　基线(缓冲液)

　　负载(固定抗体)

　　基线2

　　结合(注入抗原)

　　解离(缓冲液)

　　优势：无需微流控，可测细胞裂解液、血清

　　3. ITC(唯一提供完整热力学信息)

　　原理：每次滴定抗原到抗体溶液中，测量放热/吸热

　　输出：KD、ΔH(焓变)、ΔS(熵变)、化学计量比(n)

　　要求：

　　抗体浓度 ≈ 10–100 × KD

　　缓冲液匹配(避免稀释热干扰)

　　局限：样品消耗大，不适合 KD < 10 nM 或 >100 μM

　　4. ELISA(间接法，适合初筛)

　　操作：

　　包被抗原于板底

　　加梯度稀释抗体

　　酶标二抗 + 显色

　　拟合 OD vs [Ab] 曲线 → 计算 EC50(非真实 KD，但可比较相对亲和力)

　　注意：EC50 受包被效率、价态影响，不能替代 KD

　　5. MST(超低样品消耗)

　　标记建议：荧光标记小分子抗原(避免标记大分子抗体影响结合)

　　缓冲液灵活：可含 10% 血清、DMSO(适合药物筛选)

　　适用：膜蛋白、难溶蛋白、弱相互作用(KD 达 mM 级)

       来源：网络