MST微量热涌动转录因子和dna结合分析

　　“微量热涌动转录因子和DNA结合分析”应是指利用微量热泳动技术(MicroScale Thermophoresis, MST) 来研究转录因子(Transcription Factor, TF)与DNA序列之间的相互作用。这是一种高灵敏度、低样品消耗、溶液相的生物分子互作分析方法，特别适用于弱亲和力、难纯化或膜相关蛋白的研究。

　　MST 分析 TF–DNA 结合的实验流程

　　(1)分子标记

　　通常标记 DNA(更稳定、易合成)：

　　使用 5′ 或 3′ 荧光修饰的寡核苷酸(如 FAM、Cy5)

　　序列含已知 TF 结合位点(如 NF-κB: 5′-GGGRNYYYCC-3′)

　　也可标记蛋白(若抗体或标签可用)：

　　His-tag + anti-His-Cy5 抗体

　　GFP 融合蛋白(直接绿色荧光)

　　推荐：标记 DNA，避免蛋白标记影响其折叠或DNA结合域。

　　(2)样品准备

　　蛋白要求：

　　纯度 >80%

　　无聚集(可通过 SEC-MALS 验证)

　　浓度准确(A280 或 BCA)

　　(3)MST 测量

　　将 DNA 与不同浓度 TF 混合，室温孵育 10–30 min

　　吸入 Premium Coated Capillaries(防吸附)

　　仪器参数设置：

　　LED 功率：20–60%(避免光漂白)

　　MST 功率：40–80%(根据信号调整)

　　On-time：30 s，Off-time：5 s

　　(4)数据分析

　　仪器自动记录 荧光归一化热泳曲线

　　拟合得到 结合等温线(Binding Isotherm)

　　计算 解离常数 KD

　　KD 解读：

　　KD = 10 nM：高亲和力(典型特异性 TF–DNA)

　　KD = 1–10 μM：弱/非特异性结合

       来源：网络