脲酶测定(比色法)国标操作流程

　　脲酶(Urease)测定的比色法国家标准在中国主要依据 《GB/T 5009.183-2003 食品中脲酶活性的测定》(已废止，但技术原理仍被广泛沿用)，以及更新的相关标准如 《GB 5009.183-2016 食品安全国家标准 食品中脲酶活性的测定》(注：截至2025年，该标准号实际对应的是“植物性样品中脲酶活性的测定”，常用于大豆制品)。

　　标准操作流程(简化版，依据 GB 5009.183-2016)

　　【试剂】

　　磷酸盐缓冲液(pH 6.95)：0.15 M Na₂HPO₄ + 0.15 M KH₂PO₄

　　尿素溶液(56 g/L)：用上述缓冲液配制，现配现用

　　显色剂 A(苯酚溶液)：1% 苯酚 + 0.05% 亚硝基铁氰化钠

　　显色剂 B(碱性次氯酸盐)：0.5% NaOH + 0.25% NaClO

　　氨标准储备液：1.00 mL 含 0.1 mg N(≈0.121 mg NH₃)

　　【步骤】

　　样品处理：

　　称取 0.5–1.0 g 大豆粉，加 10 mL 缓冲液，振荡提取

　　酶反应：

　　取 1 mL 样品提取液 + 9 mL 尿素溶液

　　30 ± 0.5°C 水浴 30 分钟(严格控温!)

　　终止反应：

　　加入 10 mL 20% TCA(三氯乙酸)终止酶活

　　显色：

　　取上清液 1 mL + 显色剂 A 2.5 mL + 显色剂 B 2.5 mL

　　室温避光放置 30 分钟

　　比色：

　　630 nm 测吸光度(A)

　　空白对照：

　　先加 TCA 再加尿素(灭活酶)

　　标准曲线：

　　用氨标准液(0–10 μg N)同步显色

　　【结果计算】

　　脲酶活性以 “每克样品每分钟释放的氮微克数(μg N·g⁻¹·min⁻¹)” 表示：

　　A：样品吸光度

　　A0​：空白吸光度

　　V：反应总体积(mL)

　　D：稀释倍数

　　m：样品质量(g)

　　t：反应时间(min)

　　k：标准曲线斜率(μg N / 吸光度单位)

　　判定标准(大豆制品)：

　　脲酶活性 < 0.05 U：生熟度合格(完全钝化)

　　0.05–0.4 U：轻度活性(可接受)

　　> 0.4 U：生豆味重，抗营养因子高，不合格

       来源：网络