悬浮细胞tunel染色详细实验步骤

　　悬浮细胞(如 Jurkat、K562、原代淋巴细胞、某些肿瘤细胞系)进行 TUNEL 染色(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling)是检测细胞凋亡(apoptosis)的金标准方法之一。该技术通过标记 DNA 断裂产生的 3'-OH 末端，特异性识别晚期凋亡或坏死细胞中的 DNA 片段化。

　　第一部分：实验前准备

　　细胞准备：诱导细胞凋亡(如使用化疗药物、射线等)。设置阴性对照组(正常细胞)和阳性对照组(用DNA酶I处理，产生大量DNA断裂)。

　　试剂准备：

　　4%多聚甲醛固定液(PBS配制，pH 7.4，现用现配或分装冻存)。

　　透膜液：0.1% Triton X-100(用PBS配制)。

　　TUNEL检测试剂盒(商业化的，如Roche、Invitrogen、碧云天等品牌，通常包含TdT酶和标记的dUTP)。

　　PBS缓冲液。

　　DAPI染液(或其他细胞核染料，如PI)。

　　抗荧光淬灭封片剂。

　　载玻片预处理：用多聚赖氨酸处理载玻片，以增强细胞在玻片上的粘附力，防止在后续步骤中脱落。

　　第二部分：染色流程(全程轻柔操作，尽量避光)

　　细胞收集与计数：

　　收集细胞悬液(包括培养基中的漂浮细胞，这部分常含有大量凋亡细胞)。

　　轻柔离心(如300g， 5分钟)，小心弃上清，避免吸走细胞团。

　　固定：

　　用预冷的PBS重悬细胞，洗涤一次。

　　用4%多聚甲醛(PBS配制)重悬细胞，室温固定30分钟。避免固定过久导致DNA交联，影响TdT酶进入。

　　洗涤：

　　加入PBS，离心(300g， 5分钟)，弃上清。重复洗涤2次，彻底去除固定液。

　　透膜：

　　用0.1% Triton X-100(溶于PBS) 冰上孵育10分钟，使细胞膜通透，让反应试剂能进入细胞核。

　　洗涤：用PBS洗涤细胞2次(300g， 5分钟)。

　　TUNEL反应：

　　根据试剂盒说明书，在离心管中配制TUNEL反应混合液(TdT酶 + 标记的dUTP)。

　　用反应液重悬细胞，37°C避光孵育60分钟。务必设置阴性对照：一组不加TdT酶，只用标记液。

　　终止与洗涤：

　　加入PBS终止反应，离心洗涤细胞3次，以充分去除未结合的荧光染料，降低背景。

　　第三部分：制片与观察(关键步骤之一)

　　制备细胞涂片：

　　z佳方法：使用细胞离心涂片机。将细胞悬液加入cytospin专用样品槽，离心(如500rpm， 5分钟)，使细胞均匀、单层地平铺在载玻片上。

　　替代方法：若没有涂片机，可将细胞悬液滴在处理过的载玻片上，室温自然沉降30分钟，然后小心吸除多余液体(此法细胞分布不均)。

　　细胞核复染：

　　滴加DAPI染液(或PI)覆盖细胞，室温避光孵育5-10分钟。

　　封片：

　　用PBS轻轻漂洗玻片，甩干。

　　滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，避免气泡。

　　用指甲油密封盖玻片边缘。

　　第四部分：观察与分析

　　荧光显微镜观察：

　　凋亡细胞：在FITC通道(激发光488nm，发射光525nm左右)下观察，细胞核呈明亮的绿色荧光。

　　所有细胞核：在DAPI通道(激发光350nm左右，发射光460nm左右)下观察，显示蓝色荧光。

　　结果分析：

　　随机选择多个视野，计数总细胞数(DAPI蓝色)和TUNEL阳性细胞数(绿色)。

　　凋亡率(%) = (TUNEL阳性细胞数 / 总细胞数)× 100%。

　　也可使用流式细胞术进行更精确的定量分析(流程类似，最后一步是在流式管中用PBS重悬细胞，上机检测)。

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