小鼠肝脏he染色流程与关键技巧

　　流程详解与关键技巧：

　　第一阶段：样本获取与固定(关键!)

　　麻醉与取材：采用符合伦理的麻醉方式(如吸入异氟烷)。打开腹腔后，迅速取出肝脏。用锋利的刀片切成 < 0.5 cm厚的组织块(太厚固定不彻底)。

　　立即固定：立即浸入足量(体积为组织10倍以上)的 4%中性缓冲多聚甲醛 中。这是防止组织自溶和变形的z关键一步。

　　固定时间：室温下固定 24-48小时。时间不足会导致固定不佳;时间过长会使组织变脆。

　　第二阶段：脱水、透明、浸蜡与包埋

　　此步骤目的是用石蜡支持组织，以便切成薄片。

　　脱水：通过梯度酒精(70% → 80% → 95% → 100% I → 100% II)逐步去除组织中的水分。

　　透明：用二甲苯替代酒精，使组织透明。

　　浸蜡：在熔化的石蜡中浸渍，使石蜡充分渗透组织。

　　包埋：将组织块置于包埋盒中，倒入液态石蜡，冷却后形成蜡块。

　　第三阶段：切片、展片与烤片

　　切片：用石蜡切片机将蜡块切成 4-6 μm 厚的连续薄片。

　　展片：将切片漂浮在40-45°C的温水中展开，再用载玻片捞起。

　　烤片：将载玻片置于60°C烘箱中烘烤 30-60分钟，使切片牢固粘附。

　　第四阶段：HE染色(核心步骤)

　　脱蜡至水：将切片依次浸入：二甲苯I(10分钟)→ 二甲苯II(10分钟)→ 100%酒精I → 100%酒精II → 95% → 80% → 70%酒精(各3-5分钟)→ 蒸馏水。目的是去除石蜡并水化。

　　苏木精染色：浸入哈里斯苏木精染液中，染色 3-8分钟(时间随染液新旧调整)。细胞核被染成深蓝色。

　　分化：浸入 1%盐酸酒精(70%酒精配制)中 数秒。此步骤是关键，目的是洗去细胞质等非核结构上过染的苏木精，使核的染色更清晰。镜下控制至核蓝紫色，背景基本无色。

　　返蓝：用流水冲洗15-30分钟，或浸入弱碱性水(如0.1%氨水)中数秒，使细胞核的蓝色更鲜亮、稳定。

　　伊红复染：浸入0.5-1%伊红Y水溶液(或酒精溶液) 中，染色 1-3分钟。细胞质被染成粉红色。

　　脱水、透明、封片：

　　快速梯度脱水：80% → 95% → 100% I → 100% II酒精(各数秒至1分钟)。

　　透明：二甲苯I → 二甲苯II(各2-5分钟)。

　　封片：从二甲苯中取出，稍晾干(勿完全干)，滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片封存。

　　第五阶段：镜检与结果分析

　　待封片剂凝固后，在光学显微镜下观察。

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