细胞transwell实验标准实验流程

　　Transwell 实验(又称跨膜迁移/侵袭实验)是研究细胞迁移(migration)和侵袭(invasion)能力的经典体外模型，广泛应用于肿瘤转移、免疫细胞趋化、血管生成及药物筛选等领域。其核心原理是利用带有微孔滤膜的 Transwell 小室，模拟细胞穿越基底膜或内皮屏障的过程。

　　标准实验流程(以 24-well 板为例)

　　材料准备

　　Transwell 小室(24-well, 8.0 μm)

　　Matrigel(BD Biosciences，用于侵袭实验)

　　细胞悬液(无血清培养基重悬，1–5×10⁵ cells/mL)

　　下室培养基(含 10% FBS 或趋化因子)

　　固定液：4% 多聚甲醛 或 甲醇

　　染色液：0.1% 结晶紫(Crystal Violet) 或 DAPI

　　步骤详解

　　1. Matrigel 包被(仅侵袭实验)

　　Matrigel 4°C 预冷，用无血清培养基稀释(通常 1:8–1:10);

　　每小室加 50–100 μL 稀释 Matrigel;

　　37°C 孵育 30–60 min 成胶。

　　注意：Matrigel 需全程冰上操作，避免提前凝固。

　　2. 细胞接种

　　上室：加入 200–300 μL 无血清细胞悬液(如 2×10⁴ cells);

　　下室：加入 600–800 μL 含 10% FBS 培养基(或特定趋化因子);

　　对照组：下室用无血清培养基(验证非趋化性迁移)。

　　3. 培养

　　37°C、5% CO₂ 培养 12–48 小时(时间依细胞类型优化)：

　　快速迁移细胞(如巨噬细胞)：6–12 h

　　肿瘤细胞(如 MDA-MB-231)：24–48 h

　　4. 去除上室未迁移细胞

　　用棉签轻柔擦去上室内的细胞和 Matrigel;

　　PBS 轻洗 1–2 次。

　　5. 固定与染色

　　4% 多聚甲醛固定 15–30 min;

　　0.1% 结晶紫染色 10–20 min;

　　PBS 洗去浮色。

　　6. 成像与定量

　　显微镜下随机选取 3–5 个视野(200×)拍照;

　　定量方法：

　　手动计数迁移细胞数;

　　或用 ImageJ 软件分析染色面积/光密度。

　　高通量替代：使用 Calcein-AM 活细胞染料，荧光酶标仪读数(Ex/Em = 485/530 nm)。

       来源：网络