wb实验胶孔不明显

　　在 Western Blot(WB)实验中，如果胶孔不明显(即上样孔边界模糊、条带弥散、样品“漏出”或“拖尾”)，通常表明制胶、上样或电泳环节存在问题。

　　1. 上样问题(常见!)

　　样品制备：

　　未加或Loading Buffer量不足：这是可能的原因!Loading Buffer中的溴酚蓝(蓝色)或酚红(粉色) 是显示胶孔的染料，同时其中的甘油增加样品密度，使其沉入孔底。务必确认样品已与Loading Buffer充分混合并煮沸变性。

　　样品盐浓度或pH过高：会干扰样品在浓缩胶中的堆积，导致条带扭曲。可通过透析或沉淀法脱盐。

　　样品中含有不溶性杂质或颗粒：会上样时堵塞枪头或胶孔，导致上样不均。上样前务必高速离心(12000-14000rpm，10-15分钟)，取上清上样。

　　上样操作：

　　手法不当：枪头未垂直插入孔中，或插得太深戳到了胶的底部，导致样品从孔底漏出。应将枪头尖端刚好置于加样孔上方，缓慢、平稳地推出样品，让样品自然沉入孔底。

　　产生气泡：快速上样会在孔内产生气泡，将样品挤到旁边孔中。务必缓慢上样。

　　未使用Marker或Marker失效：一个好的蛋白Marker是判断胶孔状态和电泳是否正常的重要参照。务必使用新鲜、可信的Marker。

　　2. 制胶问题

　　浓缩胶质量问题：

　　凝固不完全：AP(过硫酸铵)或TEMED失效、用量不足，或室温过低，导致浓缩胶未完全聚合，呈“鼻涕状”，无法有效堆积蛋白。确保试剂新鲜，制胶后静置足够时间(通常>30分钟)使其充分凝固。

　　配方或pH错误：浓缩胶的Tris-HCl缓冲液pH应为6.8，分离胶为8.8。配错会导致蛋白无法正常堆积。

　　胶板组装问题：

　　玻璃板不洁净：残留的旧胶、灰尘会影响灌胶和凝固。

　　底部漏胶：制胶架或封边条(Spacer)未夹紧，导致灌胶时漏液，底部不平。灌完分离胶后可用水或异丙醇封顶检查是否泄漏，并确保凝固后倒掉封顶液并吸干。

　　梳子问题：梳子未完全插入，或插入时有气泡，导致加样孔形状不规则、大小不一。插入梳子时保持水平，缓慢插入，避免气泡。

　　3. 电泳问题

　　电泳缓冲液：

　　重复使用次数过多：缓冲液离子强度下降，pH改变，会导致电泳效率低下，条带扭曲、扩散。使用新鲜配制的1x电泳缓冲液。

　　配方错误：SDS或甘氨酸浓度不准。

　　电泳条件：

　　起始电压过高：蛋白在浓缩胶中需要被“压”成一条细线，如果一开始电压太高(如>120V)，产热过多，会导致条带受热不均，出现“微笑”(两边快中间慢)或“哭脸”现象。推荐浓缩胶阶段使用恒压80-100V，待溴酚蓝进入分离胶后再调高至120-150V。

　　电泳槽过热：确保电泳槽内有足够的缓冲液散热，或在冷库、冰水中进行电泳。

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