超薄切片透射电镜制备流程

　　超薄切片透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)是观察细胞和亚细胞结构高分辨率超微结构的金标准技术，广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域。在生命科学研究中，它尤其用于观察线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、细胞膜、病毒颗粒、细胞骨架等纳米级结构。

　　超薄切片制备流程(生物样品)

　　1. 取材与固定

　　快速取材：组织块 ≤ 1 mm³，避免缺氧导致结构破坏。

　　初级固定：2.5% 戊二醛(Glutaraldehyde)在磷酸或 cacodylate 缓冲液中，4℃ 固定 2–24 小时 → 交联蛋白质，保存结构。

　　次级固定(后固定)：1% 锇酸(OsO₄)固定 1–2 小时 → 固定脂质(如膜结构)，并增加电子密度。

　　2. 脱水

　　梯度乙醇或丙酮脱水(如 30% → 50% → 70% → 90% → 100% ×2)，每步 10–15 分钟。

　　目的：去除水分，为树脂渗透做准备。

　　3. 树脂渗透与包埋

　　过渡液：乙醇/丙酮 + 树脂(如 Epon 812、Spurr’s、Araldite)按比例混合。

　　纯树脂渗透：多次更换，真空或常温下数小时至过夜。

　　包埋：将样品放入胶囊或模具中，加入新鲜树脂，60℃ 聚合 24–48 小时，形成硬块。

　　4. 修块与定位

　　在体视显微镜下用刀片修出包含目标区域的梯形小面(约 1 mm²)。

　　可结合半薄切片(0.5–1 μm)进行光镜预观察，定位感兴趣区域(如特定细胞层)。

　　5. 超薄切片

　　使用超薄切片机(Ultramicrotome)配合玻璃刀或金刚石刀。

　　切片厚度：50–90 nm(常用 70 nm)。

　　切片漂浮于刀槽水面，用铜网(常用 200 目)捞起。

　　6. 染色(增强反差)

　　醋酸铀(Uranyl acetate)：饱和乙醇溶液，染色 15–30 分钟 → 结合核酸、核糖体、膜结构。

　　柠檬酸铅(Lead citrate)：染色 2–10 分钟 → 增强蛋白质和膜的电子密度。

　　注意：铅染需在无 CO₂ 环境(如 NaOH 干燥器中)防止沉淀。

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