淋巴细胞毒性试验标准试验流程

　　淋巴细胞毒性试验(Lymphocyte Cytotoxicity Assay)是评估免疫细胞(主要是细胞毒性T细胞或NK细胞)杀伤靶细胞能力的功能性实验，广泛应用于肿瘤免疫、移植排斥、自身免疫病、疫苗评价及药物安全性研究。

　　一个典型的试验包含以下关键步骤：

　　效应细胞制备：

　　来源：外周血单个核细胞、纯化的T细胞/NK细胞、体外活化的肿瘤浸润淋巴细胞、基因工程改造的CAR-T细胞等。

　　制备：分离、纯化、计数，并用完全培养基重悬至所需浓度。

　　靶细胞制备与铺板：

　　选择：根据研究目的选择靶细胞，如特定的肿瘤细胞系、经刺激的PBMC(用于移植研究)、病毒感染的细胞等。

　　铺板：将计数后的靶细胞接种到96孔板中，通常设置不同的效靶比。

　　效靶细胞共培养：

　　将效应细胞按设定的效靶比加入含有靶细胞的孔中。

　　关键对照设置(每板必须)：

　　靶细胞自发释放孔：只有靶细胞+培养基。

　　靶细胞z大释放孔：靶细胞+裂解液(代表100%死亡)。

　　效应细胞自发释放孔：只有效应细胞+培养基(评估效应细胞自身LDH释放)。

　　培养基背景孔：只有培养基。

　　孵育与上清收集：

　　在37°C， 5% CO₂培养箱中孵育特定时间(通常4-6小时，也可延长至18-24小时，取决于研究目的)。

　　离心培养板，小心吸取各孔上清至新板中。

　　LDH活性检测：

　　向上清中加入LDH检测底物混合物。

　　避光孵育后，用酶标仪在490nm(检测波长)和630nm(参考波长) 处读取吸光度值。

       来源：网络