乳酸菌的扫描电镜制样详解与优化

　　乳酸菌(如 Lactobacillus、Streptococcus thermophilus 等)是革兰氏阳性、无芽孢、形态多为杆状或球状的益生菌。由于其个体微小(0.5–2 μm)、含水量高、细胞壁较薄，在扫描电镜(SEM) 观察中极易因脱水或电荷积累而变形、塌陷或成像模糊。因此，制样过程需格外精细，以真实保留其表面形貌(如菌毛、表面蛋白、聚集状态等)。

　　牢固固定

　　固定是保持乳酸菌自然形态的第一步，至关重要。通常采用双固定法：

　　初固定：使用2%-2.5%的戊二醛(常用磷酸缓冲液配制，pH约7.2)，在4℃下固定2小时或过夜。

　　后固定：使用1%的锇酸固定1-2小时。这一步能更好地固定细胞膜和脂类物质，并增加样品的导电性。

　　温和干燥

　　干燥是乳酸菌制样中z容易引起收缩和塌陷的环节。对于乳酸菌这类软质微生物，临界点干燥法是可靠的方法。该方法通过在临界点状态下消除气液界面，使液体不经表面张力直接转化为气体，从而z大限度地保护微细结构。

　　在操作中，样品经乙醇脱水后，需用醋酸异戊酯置换乙醇，再放入临界点干燥仪中用液态二氧化碳进行干燥。

　　均匀导电

　　乳酸菌等生物样品不导电，直接观察会导致图像失真。因此，必须进行导电处理。常用的方法是离子溅射镀膜，在样品表面喷镀一层几纳米到几十纳米厚的金或金钯合金膜。

　　镀膜前，确保样品已完全干燥并牢固地粘在样品台上。

　　镀膜时，使用旋转样品台可以使金属膜覆盖得更加均匀。

　　注意事项

　　菌体收集与分散：收集菌体时，离心速度不宜过高(如8000rpm，3-5分钟)，避免损伤细胞。在每一步换液时，可轻柔吹打或用滴管来回吸几下，以打散菌块，防止菌体聚集影响观察。

　　避免污染：全程使用无菌技术操作，防止外来微生物污染样品。

　　安全第一：戊二醛、锇酸等试剂有毒，务必在通风橱中操作，并做好个人防护。废液也需专门收集处理。

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