使用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope, SEM)观察大肠杆菌(Escherichia
coli)可以清晰地展示其杆状形态、表面结构(如鞭毛、菌毛、荚膜)以及与其他细胞或材料的相互作用。然而，SEM需要在高真空下工作，而生物样品富含水分且不导电，因此必须经过一系列精细的制样步骤才能获得高质量的图像。
详细制样步骤
步骤1: 样品收集与初步处理
培养：在适宜的液体培养基(如LB肉汤)中培养大肠杆菌至对数生长期(OD600 ≈ 0.6-0.8)，此时细胞活性高、形态典型。
收集：
取适量菌液(如1-5 mL)于离心管中。
低温离心：在4°C下，以适当转速(如5000-8000 rpm)离心5-10分钟，形成菌体沉淀。低温有助于减缓代谢活动。
清洗：
小心弃去上清液。
加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)轻轻重悬菌体。
重复离心和清洗1-2次，以去除培养基中的盐分和有机物，避免干扰固定剂。
步骤2: 化学固定 (Chemical Fixation)
这是z关键的一步，通常采用双重固定法。
初次固定 (Primary Fixation)：
用预冷的2.5% 戊二醛(Glutaraldehyde)溶液(溶于0.1 M PBS)重悬菌体沉淀。
在4°C下固定1-2小时。
作用：戊二醛是一种交联剂，能与蛋白质的氨基等基团反应，形成坚固的网状结构，稳定细胞的整体形态和内部结构。
清洗：
离心弃去戊二醛溶液。
用预冷的PBS清洗3次，每次10-15分钟，彻底去除残留的戊二醛。
二次固定 (Post-fixation)：
用1% 锇酸(Osmium Tetroxide, OsO₄)溶液(溶于0.1 M PBS)重悬菌体。
在室温或4°C下避光固定1-2小时。
作用：锇酸能与脂质发生强烈反应，使细胞膜等脂质结构变黑并稳定，同时增加样品的整体电子密度，显著提高图像反差。
再次清洗：
离心弃去锇酸溶液(剧毒!需专门废液处理)。
用预冷的去离子水或PBS清洗3次，每次10分钟，彻底去除锇酸。
步骤3: 脱水 (Dehydration)
目的：逐步用可挥发的有机溶剂取代细胞内的水分。
方法：采用梯度乙醇(或丙酮)脱水。
50% 乙醇 / 水混合液：10-15分钟
70% 乙醇：10-15分钟
80% 乙醇：10-15分钟
90% 乙醇：10-15分钟
100% 乙醇：3次，每次15-20分钟
关键：每一步都必须充分，确保水分被完全置换。z后的100%乙醇应更换两次。
步骤4: 干燥 (Drying) - 关键步骤，防止结构塌陷
直接空气干燥会导致巨大的表面张力，使细胞严重变形。必须采用特殊干燥技术：
临界点干燥 (Critical Point Drying, CPD) - 推荐首选
原理：利用物质在临界点(临界温度和临界压力)时气液界面消失的特性，避免了液体到气体相变过程中的表面张力。
步骤：
将脱水后的样品从100%乙醇转移到液态二氧化碳(CO₂)中。由于乙醇与CO₂不互溶，需先用中间溶剂(如醋酸异戊酯)过渡，或通过多次置换CO₂来驱除乙醇。
将样品舱密封，加热加压，使CO₂达到其临界点(31.1°C, 73.8 bar)。
在临界点以上，缓慢释放压力，CO₂以超临界流体形式逸出，不会产生液-气界面。
降至常压常温后，得到完全干燥且结构完好的样品。
优点：能z好地保存生物样品的自然三维结构。
缺点：设备昂贵，操作相对复杂。
冷冻干燥 (Freeze Drying / Lyophilization)
原理：将样品急速冷冻，然后在高真空下使冰直接升华(固相→气相)，跳过液相。
要求：需要专业的冷冻干燥机。
注意：如果冷冻速度不够快，形成的冰晶会刺破细胞膜，造成损伤。
空气中干燥(仅用于粗略观察)
将少量菌液滴在载片上，直接风干或吹干。
结果：细胞会严重塌陷、变形，仅能观察大致轮廓，不推荐用于科学研究。
步骤5: 样品粘贴与镀膜 (Mounting and Sputter Coating)
粘贴：
将干燥后的样品用导电胶(如碳导电胶或双面碳导电胶带)小心地粘贴在SEM样品台(铝柱)上。
确保样品粘牢，接触良好。
镀膜 (Sputter Coating)：
使用离子溅射仪(Sputter Coater)在样品表面镀上一层厚度为5-20 nm的导电金属膜。
常用金属：
金(Au)：常用，导电性好，易于操作。
金/钯(Au/Pd)合金：比纯金更细的颗粒，能提供更高的分辨率。
铂(Pt)或铱(Ir)：用于超高分辨率成像。
作用：防止荷电，增强信号，保护样品。
来源：网络
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更新时间：2025-11-03