痤疮丙酸杆菌荧光定量PCR检测方法

　　痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes，原名 Propionibacterium acnes)是皮肤常驻菌群之一，也是寻常痤疮(青春痘)发病的关键微生物因素。其过度增殖可引发毛囊皮脂腺炎症反应。因此，精准定量皮肤或毛囊中的 C. acnes 数量，对于研究痤疮发病机制、评估治疗效果及益生菌干预策略具有重要意义。

　　荧光定量PCR(qPCR，Quantitative Real-Time PCR)因其高灵敏度、高特异性、快速、可定量等优势，已成为检测和定量 C. acnes 的主流分子生物学方法。

　　一、实验原理

　　荧光定量PCR通过特异性引物扩增 C. acnes 的保守基因序列(如16S rRNA基因或特异性功能基因)，并利用荧光染料(如SYBR Green)或探针(如TaqMan)实时监测PCR产物的累积量。通过与标准曲线比对，可精确计算样本中 C. acnes 的拷贝数或相对丰度。

　　二、实验流程

　　1. 样本采集

　　皮肤表面：无菌棉签擦拭面部T区、背部等痤疮好发部位

　　毛囊内容物：使用粉刺针或微吸管提取皮脂

　　皮肤活检(研究级)： punch biopsy 获取皮肤组织

　　保存：立即放入无菌PBS或DNA保存液中，–80°C保存

　　2. DNA提取

　　使用商业化的细菌DNA提取试剂盒(如Qiagen DNeasy PowerSoil Kit)

　　包括细胞裂解(机械破碎+酶解)、蛋白去除、DNA纯化与洗脱

　　提取后测定DNA浓度与纯度(A260/A280)

　　3. 引物设计与选择

　　常用靶基因：16S rRNA 基因的特异性区域

　　推荐引物(SYBR Green法)：

　　正向引物(F)：5′- GGT GAG TAA TAC CGT GGG -3′

　　反向引物(R)：5′- CAC CAC TGC TGC TGG TCG -3′

　　扩增片段：约200–300 bp

　　特异性验证：确保不扩增其他皮肤共生菌(如葡萄球菌)

　　4. 荧光定量PCR反应体系

　　5. PCR扩增程序

　　预变性：95°C，3 min

　　循环(40 cycles)：

　　95°C，10 s(变性)

　　60°C，30 s(退火/延伸)

　　熔解曲线分析：60–95°C，连续采集荧光，确认扩增特异性

　　6. 标准曲线构建(绝对定量)

　　克隆 C. acnes 16S rRNA 基因片段至质粒

　　测定质粒浓度，计算拷贝数

　　梯度稀释(如10²–10⁷ copies/μL)

　　每个稀释度进行qPCR，绘制Ct值 vs log(拷贝数) 标准曲线

　　样本Ct值代入曲线，计算 C. acnes 拷贝数

　　7. 相对定量(ΔΔCt法)

　　若无需绝对拷贝数，可使用内参基因(如总细菌16S)进行归一化，比较不同样本中 C. acnes 的相对丰度。

       来源：网络