宏基因组绝对定量的主要方法

　　方法 1：spike-in(外源内标法)

　　推荐方法

　　原理：

　　在提取DNA前，向已知质量的环境样品中加入已知数量的外源微生物或合成DNA片段(spike-in)，作为“分子标尺”。

　　测序后，通过比较spike-in 的测序读数与实际添加量，建立“测序数据 → 实际数量”的换算关系，进而推算样品中所有微生物的绝对丰度。

　　常用 spike-in 材料：

　　操作流程：

　　称取一定质量样品(如0.1 g土壤);

　　加入已知拷贝数的spike-in(如10⁶ copies);

　　同时进行DNA提取、建库、测序;

　　测序后，统计spike-in的reads数(如10,000 reads);

　　计算“每read对应的实际拷贝数”：

　　应用于所有物种：

　　优点：

　　精度高

　　可校正DNA提取、PCR扩增等技术偏差

　　适用于各种样本(粪便、土壤、水体等)

　　缺点：

　　成本增加(需购买spike-in)

　　需精确称样和加样

　　方法 2：基于16S rRNA基因拷贝数校正(间接法)

　　原理：

　　利用已知物种的16S rRNA基因拷贝数数据库(如rrnDB);

　　将宏基因组中检测到的16S序列丰度 × 拷贝数校正因子 → 推算细胞数量;

　　再结合总微生物量估算(如qPCR测16S总拷贝数)→ 实现绝对定量。

　　流程：

　　用qPCR测定样品中16S rRNA基因总拷贝数/g;

　　宏基因组分析得到各物种的相对丰度;

　　结合物种特异性16S拷贝数，计算各物种的绝对丰度。

　　优点：

　　成本较低(无需spike-in)

　　适用于已有qPCR数据的研究

　　缺点：

　　依赖数据库准确性

　　无法区分活/死细胞

　　对低丰度物种误差大

　　方法 3：宏基因组+流式细胞术(FACS)联合法

　　原理：

　　用流式细胞术直接计数样品中总微生物细胞数/mL;

　　宏基因组提供物种组成;

　　两者结合 → 各物种的绝对数量。

　　适用：

　　液体样本(如海水、血液、发酵液)

　　限制：

　　固体样本(如土壤、粪便)需有效分散成单细胞悬液

　　部分微生物难以染色或检测

　　方法 4：宏基因组+数字PCR(dPCR)

　　用dPCR精确定量关键物种或总基因拷贝数;

　　作为标尺，校正宏基因组数据;

　　适合靶向绝对定量。

       来源：网络