动物组织的透射电镜

　　动物组织的透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM) 是研究细胞超微结构的强有力工具，能够以纳米级分辨率观察细胞器、生物大分子、病毒、细胞骨架、膜系统等亚细胞结构，广泛应用于细胞生物学、病理学、神经科学、免疫学、发育生物学等领域。

　　一、透射电镜原理简述

　　原理：高能电子束穿透超薄组织切片(50–100 nm)，电子与样品中的原子相互作用，发生散射，未散射或散射角度小的电子通过物镜形成明场像，z终在荧光屏或CCD相机上成像。

　　分辨率：可达 0.1–0.3 nm，远高于光学显微镜(~200 nm)。

　　放大倍数：可达 数十万倍至百万倍。

　　二、动物组织透射电镜制样流程(关键步骤)

　　由于电子束穿透力有限且样品必须在高真空中观察，样品制备是TEM成功的关键。流程如下：

　　1. 取材(Fixation)

　　快速取材：动物处死后立即取组织(如肝、肾、脑、心肌等)，时间越短越好(<1分钟)，防止自溶。

　　大小控制：切成 1 mm³ 左右的小块(边长≤1 mm)，确保固定液充分渗透。

　　2. 初固定(Primary Fixation)

　　常用固定液：2.5% 戊二醛(Glutaraldehyde) 溶于0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2–7.4)

　　温度：4℃(冰箱中进行)

　　时间：1–2小时(小组织)至 数小时(大组织)

　　目的：交联蛋白质，保持细胞结构稳定

　　注意：戊二醛固定效果好，但可能掩盖抗原性(如后续做免疫电镜需注意)

　　3. 清洗(Rinse)

　　用 0.1 M 磷酸缓冲液 漂洗 3 次，每次 10–15 分钟

　　去除残留戊二醛，防止与后续试剂反应

　　4. 后固定(Post-fixation)

　　常用固定液：1% 锇酸(Osmium tetroxide, OsO₄)

　　温度：4℃

　　时间：1–2 小时

　　目的：

　　固定脂质(如细胞膜、线粒体膜)

　　增加电子密度，增强对比度

　　稳定细胞结构

　　注意：锇酸剧毒、易挥发，必须在通风橱中操作，避免光照

　　5. 脱水(Dehydration)

　　使用梯度乙醇或丙酮脱水：

　　50% → 70% → 80% → 90% → 95% → 100% × 3 次

　　每步 10–15 分钟

　　目的：去除水分，为树脂渗透做准备

　　6. 渗透(Infiltration)

　　使用环氧树脂(如 Epon 812、Araldite)或LR White(水溶性树脂，适合免疫电镜)

　　梯度渗透：树脂:丙酮 = 1:3 → 1:1 → 3:1 → 纯树脂 × 2–3 次

　　每步 1–2 小时，4℃或室温

　　7. 包埋(Embedding)

　　将组织转入包埋模具，加入新鲜树脂

　　60–70℃ 烘箱中聚合 24–48 小时，形成坚硬树脂块

　　8. 超薄切片(Ultramicrotomy)

　　使用超薄切片机(Ultramicrotome)和金刚石刀

　　切片厚度：50–100 nm

　　收集切片于铜网(如200目铜网)上

　　9. 染色(Staining)

　　增强电子对比度：

　　醋酸双氧铀(Uranyl acetate)：染核酸、蛋白质，50%甲醇溶液，避光染色 15–30 分钟

　　柠檬酸铅(Lead citrate)：染膜结构，染色 5–10 分钟(需避CO₂，防止碳酸铅沉淀)

　　醋酸双氧铀弱放射性，柠檬酸铅有毒，操作需戴手套，在通风处进行

　　10. 透射电镜观察

　　将铜网放入电镜样品台

　　在 60–120 kV 电压下观察

　　调整聚焦、对比度、放大倍数(常用 5,000× – 100,000×)

　　拍摄图像(数字相机或底片)

　　三、典型动物组织超微结构识别

　　四、特殊技术(进阶应用)

　　1. 免疫电镜(Immuno-TEM)

　　用胶体金标记抗体，定位特定抗原

　　可在超薄切片上进行(Post-embedding)或在包埋前(Pre-embedding)

　　2. 负染色(Negative Staining)

　　用于病毒、蛋白质复合物、细胞外结构

　　常用染液：磷钨酸(PTA)、醋酸双氧铀

　　3. 电镜原位杂交(EM-ISH)

　　结合核酸探针与金标抗体，定位特定RNA/DNA

       来源：网络