CCK8实验步骤及注意事项

　　CCK-8(Cell Counting Kit-8)是一种基于WST-8的细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒，因其操作简便、无毒、高灵敏度且无需洗涤细胞而广泛应用于生物学研究中。下面是基于权威资料整理的CCK-8实验标准步骤及核心注意事项：

　　一、 CCK-8 实验标准步骤

　　1. 细胞接种与预培养

　　接种细胞：取生长状态良好的细胞制备成悬液，接种至96孔板中。通常每孔加入100 μL细胞悬液。细胞增殖实验建议密度为 2×10³ 个/孔，细胞毒性实验建议为 5×10³ 个/孔(具体需根据细胞大小和增殖速度调整)。

　　预培养：将96孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中预培养。贴壁细胞通常需2-6小时使其贴壁，悬浮细胞则无需此步骤。

　　2. 药物处理(针对毒性实验)

　　根据实验设计，向孔中加入不同浓度的待测药物或样本，继续培养适当时间(如6、12、24或48小时)。若仅进行细胞增殖测定，可跳过此步。

　　3. 加入CCK-8试剂

　　向每孔中加入10 μL CCK-8溶液(即培养基与CCK-8体积比为10:1)。若起始培养体积为200 μL，则需加入20 μL CCK-8溶液。

　　轻轻震荡或轻拍培养板，使试剂充分混匀，但务必避免产生气泡。

　　4. 孵育显色

　　将培养板放回培养箱中孵育1-4小时。初次实验建议在0.5、1、2、4小时分别观察，以确定z佳显色时间(颜色变为橙黄色且OD值在0.8-1.5之间为宜)。

　　5. 测定吸光度(OD值)

　　使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。若仪器支持，建议使用600-650 nm作为参比波长进行双波长检测，以消除孔板划痕或浑浊带来的背景干扰。

　　6. 数据计算

　　细胞存活率(%) = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100%

　　抑制率(%) = [(Ac - As) / (Ac - Ab)] × 100% (注：As为实验孔吸光度;Ac为对照孔吸光度，含细胞、培养基、CCK-8，不含药物;Ab为空白孔吸光度，仅含培养基和CCK-8，不含细胞和药物)

　　二、 注意事项与避坑指南

　　1. 气泡干扰

　　加样时枪头应斜贴孔壁，避免直接插入液面下产生气泡。气泡会严重干扰光路，导致OD值读数异常。若产生气泡，需用无菌针头挑破或用移液器轻轻吹散。

　　2. 边缘效应与蒸发问题

　　96孔板z外圈(四周)的孔极易发生液体蒸发，导致浓度改变和误差。建议z外圈孔只加PBS或等量培养基作为缓冲，不作为测定孔使用。

　　3. 药物理化性质的干扰

　　氧化还原性物质：CCK-8依赖脱氢酶催化反应，若待测药物具有强氧化性或还原性，会直接干扰显色。建议在加CCK-8前更换新鲜培养基洗涤细胞;若药物影响较小，必须设置“含药物但不含细胞”的空白对照孔来扣除背景。

　　金属离子：终浓度为1 mM的氯化铁、硫酸铜等金属盐会显著抑制显色反应，需特别注意。

　　4. 避光操作

　　WST-8见光易降解，CCK-8试剂及加完试剂的孔板在孵育和检测前均需全程避光保存。

　　5. 细胞密度与线性范围

　　细胞接种量不宜过多(防止接触抑制影响增殖)也不宜过少(导致灵敏度下降)。建议提前制作“细胞数量-OD值”标准曲线，确保待测样品的OD值落在0.5-2.5的线性范围内。

　　6. 反应终止(可选)

　　若无法立即测定OD值，可向每孔加入10 μL 0.1 M HCl溶液或 1% (w/v) SDS溶液以终止反应。终止后的培养板可避光室温保存，并在24小时内完成测定。

　　7. 操作规范

　　建议使用多通道移液器以保证平行孔间的加样一致性;CCK-8试剂颜色与含酚红培养基接近，加样时需集中注意力防止漏加。

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