CM5芯片氨基偶联操作步骤

　　CM5芯片氨基偶联是表面等离子共振(SPR)技术中常用的配体固定方法。其核心原理是利用EDC/NHS活化剂将芯片表面的羧基转化为活性酯，进而与目标配体分子上的氨基发生共价结合。下面是标准化的操作步骤及关键注意事项：

　　一、 实验前准备

　　缓冲液配制：提前配制并过滤脱气运行缓冲液(如HBS-EP或PBS-P+)，确保无颗粒杂质;准备pH4.0~5.5的醋酸钠(NaAc)偶联缓冲液、新鲜混合的EDC/NHS活化液以及1M乙醇胺封闭液。

　　仪器初始化：开启SPR仪预热并完成自检，设定合适的实验温度(常规为25℃)。插入CM5芯片并确保密封无漏液，用去离子水和运行缓冲液冲洗流路以平衡系统。

　　预富集实验(Pre-concentration)：由于蛋白等电点(pI)决定了偶联效率，需使用不同pH值(如pH 5.5、5.0、4.5、4.0)的NaAc缓冲液稀释配体进行预实验。选择峰型z陡、结合量z大且未出现饱和现象的pH作为z佳偶联条件。

　　二、 标准偶联流程

　　芯片活化(Activation)：以约10 μL/min的流速向检测通道注入新鲜混合的EDC/NHS溶液(通常按1:1体积比)，持续进样5-10分钟。此时芯片表面的羧基被活化为反应性酯基团，软件上会观察到信号上升约100-200 RU。

　　配体固定(Immobilization)：立即切换至选定pH的配体溶液(建议浓度在10-50 μg/mL之间)，以相同流速注入检测通道。参比通道仅注入对应的空白偶联缓冲液。当共振单位(RU)达到预期固定量时停止进样。

　　剩余位点封闭(Deactivation/Blocking)：向双通道同时注入1M乙醇胺(pH 8.5)，持续约5分钟。此步骤用于封闭芯片表面未反应的活性酯基，防止后续分析物产生非特异性结合，软件上通常会观察到信号小幅回落。

　　基线稳定：封闭完成后，用运行缓冲液持续冲洗通道10-20分钟，直至检测通道与参比通道的信号完全稳定(波动≤±1 RU)，即可进入后续的结合/解离检测阶段。

　　三、 关键质控参数

　　纯度要求：待固定的配体样品纯度应高于90%，以避免杂质占据芯片表面的结合位点。

　　偶联量控制：配体的固定量需根据分子量和分析物大小合理设置。小分子通常需要较高的偶联量(如数千RU)，而大分子蛋白为避免空间位阻，一般控制在1000-5000 RU左右。

　　试剂时效：EDC和NHS活化液极易失活，必须现配现用;所有试剂在使用前均需平衡至设定的实验温度。

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