ITC送样要求：蛋白纯度、浓度与缓冲液条件

　　为了保证ITC(等温滴定量热法)实验的数据质量和成功率，样品的准备至关重要。ITC对蛋白纯度、浓度以及缓冲液条件有着非常严格的要求:

　　蛋白纯度要求

　　纯度标准：蛋白样品的纯度建议 ≥90%(z好达到95%以上)，通常需要通过 SDS-PAGE 或 HPLC(如SEC-HPLC)等方法进行验证。

　　杂质影响：杂质不仅会贡献额外的热量导致基线漂移，还可能产生假阳性结合信号。此外，蛋白样品在实验前需经过离心(如12000g离心10分钟)或0.22μm滤膜过滤，确保溶液中无肉眼可见的颗粒、气泡和沉淀，避免可溶性聚集体干扰实验。

　　浓度与体积要求

　　ITC实验的核心在于样品池(Cell)中的大分子与注射器(Syringe)中的配体之间的浓度匹配。

　　浓度配比：

　　样品池(蛋白)：通常建议浓度为 10-50 μM(理想情况下，蛋白浓度应约为解离常数 KdKd​ 的10倍左右)。

　　注射器(配体/小分子)：浓度通常是蛋白浓度的 10-20倍(例如 100-1000 μM)，以确保滴定结束时配体过量，获得完整的结合等温线。

　　未知 KdKd​ 时的经验值：如果结合力未知，可以从 20 μM 蛋白 滴定 200 μM 配体 开始尝试。

　　样品体积：

　　单次实验通常需要 ≥300 μL 的蛋白溶液(用于填满样品池并预留润洗体积)和 ≥80 μL 的配体溶液。

　　为了防止操作损耗并预留重复实验或对照实验的空间，建议每种样品至少准备 3倍以上 的实际用量(例如准备 1-5 mL)。

　　浓度准确性：蛋白的摩尔浓度必须尽可能精确(建议使用A280、HPLC或氨基酸分析法测定)，因为池体中蛋白的浓度误差会直接影响化学计量数(n值)的计算。

　　缓冲液条件(关键的一点)

　　缓冲液的匹配度直接决定了实验背景噪音的大小，是ITC实验成败的关键。

　　严格一致：样品池中的蛋白溶液与注射器中的配体溶液，必须处于完全相同的缓冲液体系中(包括盐浓度、pH值、辅因子、去垢剂等)。

　　pH与添加剂：两边的 pH值差异应小于 0.1-0.2。如果配体(小分子)溶解时需要使用 DMSO 等有机溶剂助溶，蛋白缓冲液中必须补加完全相同比例的 DMSO(通常浓度差异需控制在1%以内)，否则会产生巨大的稀释热背景。

　　z佳操作：可靠的方法是将纯化后的蛋白透析到z终的实验缓冲液中，然后将小分子配体直接溶解在这份透析后的缓冲液里。

　　还原剂选择：谨慎使用 β-ME 和 DTT，它们容易产生背景热或导致基线漂移。如果实验必需，建议用 TCEP(浓度≤1 mM) 代替。

　　其他重要注意事项

　　真空脱气：上机测试前，所有样品和缓冲液必须在实验温度下进行真空脱气处理(通常10分钟左右)，以去除溶液中的微小气泡，防止气泡进入样品池干扰搅拌和热量传导。

　　避免强酸强碱与高浓度有机溶剂：强酸、强碱以及高浓度的有机溶剂(如 >50% DMSO)可能会腐蚀ITC仪器的哈氏合金(Hastelloy)样品池，通常不建议使用。

　　样品稳定性：蛋白在设定的实验温度(通常为2-80℃)下，必须能保持至少1小时以上的稳定，不发生沉淀、降解或粘度突变。

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