通过ITC测定生物样品的活性浓度

　　利用等温滴定量热法(ITC)测定生物样品的活性浓度，是ITC技术的一项经典且极具价值的应用。与传统的紫外吸收(如OD280)或BCA等总蛋白浓度测定方法不同，ITC测定的是“活性浓度”，即溶液中真正具备结合功能、能够参与分子识别的分子的实际浓度。

　　下面是利用ITC测定生物样品活性浓度的核心原理、实验设计与具体步骤：

　　实验设计与关键条件

　　为了保证活性浓度测定的准确性，实验设计需要满足以下核心条件：

　　强结合体系：待测生物分子与配体之间必须具有较强的亲和力(通常要求解离常数 Kd 在纳摩尔至微摩尔级别)，以确保滴定曲线呈现清晰的S形，拐点明确。

　　已知浓度的配体：注射器中的配体浓度必须经过极其精确的测定(作为标准品)，其浓度通常设定为样品池中预计生物分子浓度的10到20倍。

　　缓冲液严格匹配：样品池中的生物样品溶液与注射器中的配体溶液，必须使用完全相同的缓冲体系(pH值差异不能超过0.2)，以消除混合热和稀释热的干扰。

　　具体测定步骤

　　样品准备与脱气：

　　将待测生物样品(如抗体)配制成预估浓度的溶液，置于样品池(Cell)中。

　　将已知精确浓度的配体溶液装入注射器(Syringe)中。

　　实验前，所有样品和缓冲液均需进行真空脱气处理，防止气泡产生干扰微量热信号的检测。

　　进行滴定实验：

　　在恒定的温度下(如25℃或30℃)，将配体以固定的体积(如2-10 μL)分多次(如15-20次)自动注入样品池。

　　仪器会实时记录每次注入后，为了维持样品池与参比池温度一致所需的功率补偿，从而得到一系列放热或吸热的峰。

　　数据分析与浓度计算：

　　对原始热功率峰进行积分，得到每次注入的总热量，并将其对“配体/生物分子”的摩尔比作图，得到结合等温线。

　　利用ITC配套软件(如Origin, NanoAnalyze等)对曲线进行非线性拟合。拟合结果会直接给出反应的化学计量数(n值，即结合位点数)。

　　计算公式：根据拟合得出的n值和已知的配体浓度，即可计算出样品池中活性生物分子的实际摩尔浓度。

　　活性浓度 = (配体浓度 × 滴定至饱和时的摩尔比) / n值

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