小分子药物与靶蛋白亲和力测定（Biacore法）

　　使用Biacore(基于表面等离子体共振，SPR技术)测定小分子药物与靶蛋白的亲和力，是药物研发中验证“药物-靶点”结合的金标准方法。

　　与小分子药物筛选常用的IC50(半抑制浓度)不同，Biacore能直接测定平衡解离常数(KD)，并提供结合速率(ka)和解离速率(kd)，帮助你从动力学层面理解药物是如何“抓住”靶点的。

　　针对小分子(通常<500 Da)信号弱、易受溶剂影响的特点，我为你整理了基于Biacore的标准操作流程和关键注意事项。

　　实验策略

　　在小分子检测中，由于分子量小，结合产生的信号(RU值)较弱。为了获得高质量数据，通常采用以下两种固定策略之一：

　　捕获法(推荐)： 将蛋白(靶点)固定在芯片表面，小分子作为流动相流过。

　　优势： 蛋白活性保持较好，适合大多数情况。

　　注意： 需使用CM5芯片并通过氨基偶联或捕获试剂盒固定蛋白。

　　反向法： 将小分子固定在芯片上，蛋白流过。

　　优势： 适合极不稳定的蛋白。

　　劣势： 小分子固定化可能改变其构象，且容易产生非特异性结合信号。

　　下面流程以“固定蛋白，流动小分子”的标准模式为例。

　　标准实验流程 (SOP)

　　1. 样品准备 (关键步骤)

　　靶蛋白：

　　浓度：建议 >20 µg/mL(用于偶联)。

　　缓冲液：需置换为无胺缓冲液(如醋酸钠)，严禁含有Tris或甘氨酸，因为它们会干扰偶联反应。

　　小分子化合物：

　　溶剂： 小分子通常难溶于水，需用 100% DMSO 溶解母液(建议浓度 10 mM)。

　　浓度梯度： 设置 5-7 个浓度梯度(通常覆盖 0.1×KD 到 10×KD 范围)。

　　溶剂校正： 由于流动相中含有DMSO，必须配置一系列不同DMSO浓度的缓冲液(如4.5%-5.8%)用于制作溶剂校正曲线，以扣除DMSO浓度波动带来的折射率差异。

　　2. 芯片偶联 (固定蛋白)

　　通常使用 CM5芯片(羧甲基葡聚糖表面)：

　　活化： 使用 EDC/NHS 混合液活化芯片表面，形成活性酯。

　　偶联： 注入稀释在醋酸钠缓冲液中的蛋白，使其共价结合在芯片上。

　　技巧： 对于小分子检测，蛋白固定量不宜过高(通常 2000-5000 RU)，以避免空间位阻或非特异性结合。

　　封闭： 注入乙醇胺封闭未反应的活性位点。

　　3. 结合测试 (Run)

　　运行缓冲液： 含有一定比例 DMSO(通常为 1%-5%)的 PBS 或 HBS 缓冲液，以匹配小分子样品的溶剂环境。

　　进样： 按照从低浓度到高浓度的顺序注入小分子。

　　结合时间： 通常 60-180 秒(视结合快慢而定)。

　　解离时间： 通常 120-600 秒(小分子解离通常较快，但为了拟合准确需足够时长)。

　　再生： 每次循环后，注入再生液(如 10 mM Glycine-HCl pH 2.0)去除结合的小分子，使芯片表面恢复初始状态。

　　4. 数据分析

　　使用 Biacore 评估软件(如 Insight或Evaluation Software)进行处理：

　　溶剂校正： 应用 DMSO 校正曲线扣除背景噪音。

　　双参考扣除： 减去参比通道(未固定蛋白的通道)和零浓度缓冲液进样的信号，消除非特异性结合和系统噪音。

　　模型拟合： 通常选择 1:1 Langmuir 结合模型 进行全局拟合，计算 ka、kd 和 KD。

       来源：网络