蛋白亲和力测定的详细技术选型指南

　　蛋白亲和力测定是定量描述两个或多个蛋白质(或蛋白质与其他分子)结合强度的过程。在药物研发和基础生物学研究中，这通常用解离常数( KD​ )来表示。

　　根据你的研究目的(是需要动力学细节、热力学机制，还是快速筛选)，你可以选择不同的技术平台。目前主流的技术主要分为表面固定技术(如 SPR、BLI)和溶液相技术(如 ITC、MST)。

　　技术对比与选型

　　技术深度解析

　　1. SPR (表面等离子共振) —— 动力学的首选

　　SPR 是目前应用广泛的无标记检测技术，被《中国药典》收录。

　　原理：将一种蛋白(配体)固定在芯片表面，另一种蛋白(分析物)流过芯片。结合会导致芯片表面折射率变化，从而实时监测结合/解离过程。

　　优点：能精确测定结合速率( kon )和解离速率( koff )，告诉你药物是“结合得快”还是“结合得稳”。

　　注意：需要将蛋白固定在芯片上，若固定方式不当可能导致蛋白失活或产生位阻效应。

　　2. ITC (等温滴定量热法) —— 机制研究的王者

　　ITC 是在溶液中直接测量分子结合时释放或吸收的热量。

　　原理：通过滴定过程测量热效应，一次实验即可得到全套热力学参数。

　　优点：唯一能直接测定化学计量比( n )的技术(例如：是1个抗体结合1个抗原，还是2个?)。它还能告诉你结合是靠氢键(焓驱动)还是疏水作用(熵驱动)。

　　注意：样品消耗量相对较大，通量较低，不适合大规模筛选。

　　3. MST (微量热泳动) —— 省样神器

　　原理：利用红外激光产生局部温度梯度，监测分子在温度场中的运动(热泳动)。分子结合后，其大小、电荷或水合层的变化会改变热泳动轨迹。

　　优点：样品消耗极低(微升级)，且完全在溶液中进行，甚至可以检测细胞裂解液中的蛋白互作。

　　注意：通常需要对其中一种分子进行荧光标记。

　　4. BLI (生物膜干涉) —— 快速灵活的替代者

　　原理：与 SPR 类似，但它是基于光纤生物传感器的技术，不需要复杂的微流控管路。

　　优点：操作像“蘸一下”那么简单，对样品纯度要求稍低，适合检测粗样品(如杂交瘤细胞上清)。

　　注意：动力学分辨率略低于高端 SPR 仪器。

       来源：网络