细胞扫描电镜观察：贴壁细胞与悬浮细胞制样方法

　　细胞扫描电镜(SEM)制样的核心在于“保真”——即z大程度地保留细胞在自然状态下的三维形貌，防止其在真空和电子束轰击下发生皱缩、塌陷或破裂。

　　针对贴壁细胞和悬浮细胞不同的生长特性，其制样策略有显著区别。

　　制样步骤

　　1. 培养与预处理

　　贴壁细胞：

　　载体：通常将细胞接种在放入24孔板中的盖玻片或硅片上。

　　密度：待细胞生长至60%-80%汇合度时z佳。过密会导致细胞重叠，难以观察单个细胞形态;过稀则寻找视野困难。

　　清洗：弃去培养基，用PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)轻轻漂洗2-3次，洗去残留血清蛋白。注意要沿孔壁缓慢加入，切勿直接冲刷细胞面。

　　悬浮细胞：

　　富集：收集细胞悬液，进行低速离心(通常1000 rpm左右)。

　　沉淀量：离心后的细胞沉淀肉眼可见大小应达到芝麻至绿豆大小(约1-3mm³)。沉淀太少会导致观察时找不到细胞。

　　清洗：弃上清，用PBS重悬洗涤1-2次，再次离心去上清。

　　2. 固定 (Fixation) —— 锁定形态

　　这是关键的一步，决定了细胞结构的完整性。

　　固定液：通常使用2.5%戊二醛(用0.1M磷酸缓冲液配制)。

　　操作：

　　贴壁细胞：直接向孔板或盖玻片上加入固定液，室温固定30分钟至2小时。

　　悬浮细胞：将细胞沉淀重悬于固定液中，室温固定30分钟至2小时。

　　注意：固定后的样品若不能立即进行后续步骤，可置于4℃冰箱保存，但切勿冷冻结冰，冰晶会刺破细胞膜。

　　3. 清洗与后固定 (Washing & Post-fixation)

　　清洗：用0.1M磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15分钟，彻底去除残留的戊二醛。

　　后固定(可选但推荐)：使用1%四氧化锇(OsO₄)固定1-2小时。这能更好地固定脂类物质(如细胞膜)，并增加样品的导电性和图像反差。固定后需再次用缓冲液清洗。

　　4. 梯度脱水 (Dehydration)

　　为了适应电镜的高真空环境，必须去除细胞内的水分。

　　试剂：乙醇(酒精)或丙酮。

　　流程：按照 30% → 50% → 70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100% 的浓度梯度依次浸泡。

　　时间：每个浓度梯度停留15-20分钟。

　　关键点：100%乙醇处理通常进行两次，确保水分彻底去除。

　　5. 干燥 (Drying) —— 防止塌陷

　　生物样品含水多，直接干燥会因表面张力导致细胞皱缩。

　　金标准：临界点干燥

　　使用临界点干燥仪(CPD)，利用液态CO₂置换乙醇，在临界点消除气液界面张力。这是观察细胞立体形貌的z佳方法。

　　替代方案：叔丁醇冷冻干燥

　　适用于没有临界点干燥仪的情况，也能较好地保持形态。

　　不推荐：空气自然干燥(会导致细胞严重塌陷，仅适用于对形貌要求极低的观察)。

　　6. 导电处理 (Mounting & Coating)

　　贴样：

　　贴壁细胞：将干燥后的盖玻片用导电胶带粘在样品台上。

　　悬浮细胞：将干燥后的细胞粉末或沉淀块用导电胶粘在样品台上，或用洗耳球吹去未粘牢的浮尘。

　　喷金：使用离子溅射仪喷镀一层金(Au)或铂(Pt)，厚度约10-20nm。这能消除荷电效应(图像发亮、漂移)并增强二次电子信号。

       来源：网络