细胞扫描电镜样品制备方法

　　细胞扫描电镜(SEM)样品制备的核心目标是：在真空和电子束环境下，z大限度地保持细胞原本的三维形态，并赋予样品导电性。由于细胞含水量高、质地软且不耐电子束轰击，制备过程比材料样品复杂得多。

　　操作步骤

　　1. 细胞培养与预处理

　　贴壁细胞：通常直接生长在盖玻片或专用的导电硅片上。

　　悬浮细胞：需要先通过离心收集，或者使用细胞离心涂片机(Cytospin)将其甩到载玻片上，也可以让其在多聚赖氨酸处理的盖玻片上贴附。

　　注意：细胞密度要适中，过密会导致重叠，影响形貌观察。

　　2. 化学固定

　　这是保存结构的第一步，必须迅速且彻底。

　　试剂：常用 2.5% 戊二醛(用0.1M PBS配制，pH 7.2-7.4)。

　　操作：吸去培养基，直接加入固定液，4℃下固定 2-4小时(或过夜)。

　　后固定(可选)：为了增加膜结构的对比度和导电性，有时会接着用 1% 锇酸固定 1-2 小时(需在通风橱操作，有毒)。

　　3. 清洗

　　用 0.1M PBS缓冲液 漂洗样品 3 次，每次 10-15 分钟，彻底洗去残留的戊二醛，防止其干扰后续反应。

　　4. 梯度脱水

　　绝对不能直接将含水的细胞放入干燥设备，必须逐步置换水分。

　　试剂：乙醇或丙酮。

　　梯度：30% → 50% → 70% → 90% → 100%(无水乙醇)。

　　时间：每个浓度浸泡 10-15分钟。

　　注意：100% 乙醇通常需要处理 2-3 次，确保水分完全去除。

　　5. 干燥

　　这是决定样品成败的关键。

　　方法一：临界点干燥 —— 推荐(金标准)

　　原理：利用液态CO₂置换乙醇，在临界点(31.1℃, 7.38 MPa)使气液界面消失，消除表面张力，完美保留细胞绒毛、微褶皱等精细结构。

　　适用：几乎所有贴壁细胞和悬浮细胞。

　　方法二：冷冻干燥

　　适用于含有大量冰晶的样品，或者没有临界点干燥仪的情况。

　　方法三：自然/烘干干燥 —— 不推荐

　　仅适用于细胞壁坚硬的样品(如花粉、某些细菌)。对于哺乳动物细胞，表面张力会导致细胞严重塌陷、变扁。

　　6. 导电处理

　　细胞主要由碳、氢、氧组成，不导电，直接观察会产生“荷电效应”(图像发白、漂移)。

　　操作：使用离子溅射仪进行喷金或喷铂。

　　厚度：通常 5-10 nm 即可。过厚会掩盖细胞表面的纳米级细节(如微绒毛)。

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