流式细胞术检测细胞周期：PI染色法实验仪器及步骤

　　使用流式细胞术结合碘化丙啶(PI)染色法是检测细胞周期的经典方法。其核心原理是利用PI染料能够嵌入双链DNA的特性，且其荧光强度与DNA含量成正比。通过检测细胞内DNA的相对含量，可以区分出处于不同细胞周期时相(G0/G1期、S期、G2/M期)的细胞群体。

　　实验原理

　　细胞周期分为G0/G1期(DNA含量为2N)、S期(DNA含量在2N至4N之间)和G2/M期(DNA含量为4N)。PI染料本身不能穿过完整的细胞膜，因此需要先用乙醇等试剂对细胞进行固定和透化，使PI能够进入细胞内与DNA结合。

　　由于PI也能与RNA结合，为避免RNA干扰DNA含量的准确检测，染色体系中必须加入核糖核酸酶A(RNase A)以降解RNA。z终，通过流式细胞仪检测每个细胞的PI荧光强度，并绘制成直方图，即可分析出各细胞周期时相的细胞百分比。

　　 主要试剂与仪器

　　试剂:

　　磷酸盐缓冲液 (PBS)

　　预冷的70%乙醇(需提前置于-20℃或4℃)

　　PI染色液：通常包含PI(终浓度约50 µg/mL)和RNase A(终浓度约100 µg/mL)。

　　仪器:

　　流式细胞仪(配备488 nm激光器)

　　低温离心机

　　细胞培养相关耗材(培养皿、移液管等)

　　EP管、流式上样管

　　实验步骤

　　1. 细胞收集与处理

　　取对数生长期的细胞，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶温和消化，悬浮细胞直接收集。

　　将细胞悬液转移至离心管中，建议每管收集约 1×10⁶ 个细胞。

　　在4℃条件下，以300-500g离心5分钟，弃去上清液。

　　加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，再次离心洗涤，弃上清。

　　2. 细胞固定(关键步骤)

　　轻弹管底使细胞沉淀松散，缓慢加入1 mL预冷的70%乙醇。

　　关键技巧：在加入乙醇的同时，用涡旋振荡器或移液枪轻轻吹打，使细胞充分分散，防止细胞聚团。

　　将细胞悬液置于4℃冰箱中固定至少2小时，或-20℃过夜固定，效果更佳。

　　3. PI染色

　　取出固定好的细胞，在4℃下以300-500g离心5分钟，彻底弃去上清液(乙醇)。

　　加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，离心洗涤，重复此步骤1-2次，以彻底去除残留的乙醇。

　　弃上清，轻弹管底使细胞沉淀松散。

　　每管加入500 µL PI染色液(含PI和RNase A)，用移液枪轻轻吹打混匀。

　　用铝箔纸包裹EP管，在室温下避光孵育30分钟。

　　4. 流式检测与数据分析

　　上机前准备：将染色后的细胞悬液用200-400目筛网过滤到流式上样管中，以去除细胞团块，防止堵塞仪器。

　　仪器设置：

　　使用488 nm激光激发，通过FL2或PE通道(红色荧光)收集PI信号。

　　电压设置：调整电压，使G0/G1峰(2N DNA含量)位于横坐标100-200的位置较为理想。

　　信号处理：务必勾选A(面积)、H(高度)、W(宽度)参数，用于后续去除黏连细胞。

　　数据采集：以低速上机，每个样品至少采集1-2万个单细胞事件。

　　数据分析：

　　设门P1：在FSC-A vs SSC-A散点图中圈出目标细胞群，排除碎片。

　　设门P2 (去黏连)：在PI-A vs PI-W或PI-A vs PI-H散点图中，圈出对角线上的单细胞群，排除双峰或多峰黏连细胞。

　　周期拟合：对P2门内的细胞绘制PI-A直方图，使用FlowJo等软件的细胞周期分析模块(如Watson或Dean-Jett-Fox模型)进行拟合，计算G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比。

       来源：网络