SPR芯片偶联方法有哪些？

　　SPR(表面等离子体共振)芯片的偶联(Immobilization/Coupling)是将配体(Ligand，如蛋白、抗体、DNA、小分子)稳定固定在传感器芯片表面的关键步骤。偶联策略的选择直接决定了实验的成功率、信号强度、活性保持以及芯片的可再生性。

　　选择偶联方法主要取决于：配体的化学性质(是否有氨基、羧基、生物素等)、活性保持需求(定向 vs 随机)以及实验目的(动力学测定 vs 筛选)。

　　1. 共价偶联 (Covalent Immobilization)

　　常用、稳定的方法。通过化学反应将配体永久性地结合在芯片表面的基质(通常是羧甲基葡聚糖)上。

　　A. 胺偶联 (Amine Coupling) ——通用、标准

　　原理：利用配体表面的伯胺基团(-NH₂，主要来自赖氨酸 Lys 和 N 端)与芯片表面的羧基(-COOH)反应形成酰胺键。

　　流程 (三步法)：

　　活化 (Activation)：注入 EDC/NHS 混合液，将芯片表面的 -COOH 活化为不稳定的 NHS 酯。

　　偶联 (Coupling)：注入配体溶液(通常在低 pH 缓冲液中，使配体带正电，利于静电预浓缩)，胺基攻击 NHS 酯，形成共价键。

　　封闭 (Deactivation/Blocking)：注入乙醇胺 (Ethanolamine)，封闭未反应的 NHS 酯，防止后续样品非特异性吸附。

　　优点：

　　适用性极广(几乎所有蛋白都有赖氨酸)。

　　结合非常牢固，耐严苛再生条件。

　　技术成熟，试剂盒普及。

　　缺点：

　　随机取向：赖氨酸遍布蛋白表面，可能导致活性位点被遮挡或朝向错误，降低活性。

　　多点位连接：可能导致蛋白构象改变。

　　适用：大多数蛋白、抗体、肽段。

　　B. 巯基偶联 (Thiol Coupling) —— 定向偶联首选

　　原理：利用配体上的游离巯基(-SH，来自半胱氨酸 Cys)与芯片表面的马来酰亚胺 (Maleimide) 或吡啶二硫 (PDE) 基团反应。

　　操作：

　　天然 Cys：如果蛋白表面有唯一的、远离活性位点的游离 Cys，可直接偶联。

　　工程改造：通过基因工程在蛋白特定位置(如 C 端)引入单个 Cys，并还原其他二硫键(需谨慎)，实现完美定向。

　　优点：

　　定向固定：确保活性位点朝向流动相，z大化结合活性。

　　均一性好。

　　缺点：

　　需要蛋白有游离 Cys 或进行突变改造。

　　巯基易氧化，需新鲜制备或保护。

　　适用：对抗体片段 (Fab)、受体胞外域等需要严格定向的蛋白。

　　C. 醛基偶联 (Aldehyde Coupling)

　　原理：氧化配体糖链上的顺式二醇生成醛基，或与 N 端氨基反应生成席夫碱，再还原稳定。

　　适用：主要用于糖蛋白(如抗体 Fc 段的糖基化位点)，可实现Fc 端固定，Fab 端朝外(定向)。

　　2. 亲和捕获 (Affinity Capture) —— 简便、可再生

　　利用高亲和力的生物对将配体“抓”在芯片上。这不是共价键，但结合力极强( KDKD​ 达 fM-pM 级)，通常视为准永久性。

　　A. 生物素 - 链霉亲和素 (Biotin-Streptavidin/NeutrAvidin) —— 金标准

　　原理：

　　芯片表面预先固定链霉亲和素 (SA) 或 NeutrAvidin (NA)。

　　注入生物素化 (Biotinylated) 的配体，被强力捕获。

　　优点：

　　万能定向：可通过化学或酶法将生物素标记在配体特定位置(如抗体 Fc 端)，实现完美定向。

　　通用性强：同一块 SA 芯片可捕获任何生物素化分子。

　　背景低：SA 芯片本身非特异性吸附极低。

　　小分子检测利器：非常适合将小分子生物素化后固定在芯片上，反向检测大分子。

　　缺点：

　　需要额外的生物素化步骤(化学标记或酶标)。

　　内源性生物素干扰(若样品中含生物素)。

　　难以洗脱再生(结合太牢，通常作为一次性使用或仅再生分析物)。

　　B. 抗体捕获 (Antibody Capture)

　　原理：

　　芯片上固定捕获抗体(如抗人 IgG Fc 抗体、抗 His 抗体、抗 Flag 抗体)。

　　注入带有相应标签(Fc, His, Flag)的目标蛋白配体。

　　优点：

　　完美定向：抗体只识别特定标签，确保配体朝向一致。

　　可再生性极佳：实验结束后，用温和缓冲液(如 Glycine pH 1.5-2.0)洗掉目标蛋白，捕获抗体仍留在芯片上，可重复使用数十次循环。

　　保持活性：避免了共价偶联的化学修饰损伤。

　　缺点：

　　需要购买或制备高质量的捕获抗体。

　　增加了实验步骤(需先流捕获抗体，再流配体)。

　　适用：抗体药物筛选、激酶/受体研究(His 标签捕获)。

　　C. DNA 杂交捕获

　　原理：芯片固定一条 DNA 链，注入互补配对的生物素化或修饰过的另一条链(连着蛋白)。

　　适用：核酸 - 蛋白相互作用研究。

　　3. 疏水/物理吸附 (Hydrophobic/Physical Adsorption)

　　原理：利用蛋白疏水区与芯片表面(如 L1 芯片的脂质层，或 C1 平面金表面)的物理吸附。

　　L1 芯片：专门用于捕获脂质体、病毒、完整细胞膜。配体(膜蛋白)嵌入脂质体中，脂质体再吸附到 L1 芯片上。这是研究膜蛋白的唯一自然状态方法。

　　缺点：结合力较弱，容易在再生步骤中脱落，非特异性吸附较高。

       来源：网络