SPR技术测定蛋白-蛋白亲和力的完整实验流程

　　表面等离子体共振 (SPR, Surface Plasmon Resonance) 是测定蛋白 - 蛋白相互作用(PPI)亲和力( KDKD​ )、动力学常数(结合速率 kon​ 、解离速率 koff )的“金标准”技术。它无需标记，可实时监测分子结合过程。

　　第一阶段：实验设计与准备 (Experimental Design)

　　在开机之前，必须完成详细的方案设计，这是成功的关键。

　　确定配体 (Ligand) 与 分析物 (Analyte)

　　配体 (Ligand)：固定在芯片表面的分子。通常选择分子量较小、稳定性好、易纯化的蛋白。

　　分析物 (Analyte)：在流动相中注入的分子。通常是待测亲和力的蛋白，需进行浓度梯度稀释。

　　原则：如果可能，尝试两种偶联方向(A 固定测 B，B 固定测 A)，以排除空间位阻或偶联导致的活性丧失。

　　选择芯片 (Sensor Chip)

　　CM5 芯片(羧甲基化葡聚糖)：通用，适用于大多数蛋白，通过氨基偶联。

　　NTA 芯片：适用于带 His 标签的蛋白(可再生，但结合力较弱，易流失)。

　　SA 芯片(链霉亲和素)：适用于生物素化蛋白(取向性好，结合牢固)。

　　Protein A/G 芯片：适用于抗体 Fc 段捕获(定向固定抗体)。

　　缓冲液匹配 (Buffer Matching) —— 至关重要

　　分析物稀释缓冲液必须与运行缓冲液(Running Buffer)完全一致(pH、盐浓度、添加剂如 Tween-20、DMSO 等)。

　　目的：消除折射率差异引起的“体积排阻效应”(Bulk Shift)，否则基线会剧烈跳动，掩盖真实信号。

　　建议：运行缓冲液通常含 0.05% Tween-20 以减少非特异性吸附。

　　浓度梯度设计

　　预计 KDKD​ 值附近设置 5-7 个浓度点。

　　范围通常为 0.1×KD0.1×KD​ 到 10×KD10×KD​ 。若未知 KDKD​ ，先做预实验(单浓度)摸索。

　　必须包含一个 0 浓度点(纯缓冲液)，用于双参考扣除。

　　第二阶段：芯片活化与配体固定 (Immobilization)

　　以常用的 CM5 芯片 + 氨基偶联 (Amine Coupling) 为例：

　　系统平衡

　　用运行缓冲液冲洗流路，直至基线稳定(噪音 < 0.1 RU)。

　　活化 (Activation)

　　注射混合液：EDC (碳化二亚胺) + NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)。

　　作用：将芯片表面的羧基 (-COOH) 活化为不稳定的 NHS 酯，可与蛋白的伯氨基 (-NH2) 反应。

　　时间：通常 7 分钟(流速 10 μL/min)。

　　配体偶联 (Coupling)

　　将配体蛋白溶解在 偶联缓冲液(通常是低 pH 乙酸钠缓冲液，pH 4.0-5.5，使蛋白带正电且暴露氨基)中。

　　注射配体溶液，使其与共价结合到芯片表面。

　　目标响应值 (Target Level)：根据公式 Rmax=(MWanalyte/MWligand)×Rligand×n×1000 计算。通常对于小分子配体，固定量较高;对于大蛋白配体，固定量适中(如 2000-5000 RU)，以避免空间位阻和质量传输限制。

　　封闭 (Deactivation/Blocking)

　　注射 乙醇胺 (Ethanolamine, pH 8.5)。

　　作用：封闭未反应的 NHS 酯，防止后续分析物非特异性结合到芯片骨架上。

　　参考通道 (Reference Cell) 制备

　　必须设置：选择一个流道(Flow Cell 1)进行完全的活化 - 封闭操作，但不偶联配体(或偶联一个无关蛋白如 BSA)。

　　作用：用于扣除非特异性吸附和缓冲液折射率变化(Bulk effect)。

　　第三阶段：结合动力学检测 (Kinetics Run)

　　进样序列设置

　　按浓度从低到高注入分析物(避免高浓度残留影响低浓度)。

　　每个浓度循环包含：

　　基线 (Baseline)：缓冲液流过，稳定信号。

　　结合相 (Association)：注入分析物溶液(通常 60-180 秒)。观察曲线上升。

　　解离相 (Dissociation)：切换回缓冲液(通常 120-600 秒，甚至更长)。观察曲线下降。

　　再生 (Regeneration)：注入再生液，去除结合的分析物，使基线回到初始状态。

　　再生条件筛选 (Regeneration Optimization)

　　目的：在不破坏配体活性的前提下，彻底洗脱分析物。

　　常用再生液：

　　弱酸：10 mM Glycine-HCl (pH 1.5 - 2.5)。

　　弱碱：10 mM NaOH。

　　高盐：2 M MgCl₂ 或 NaCl。

　　去污剂：0.05% SDS。

　　测试方法：在正式实验前，结合一个高浓度分析物，尝试不同再生液，寻找能瞬间使信号归零且不损伤配体结合能力的条件。

　　运行参数优化

　　流速：通常 30-50 μL/min。流速过低会导致质量传输限制(Mass Transport Limitation, MTL)，使测得的 konkon​ 偏小。

　　温度：通常 25°C，需恒定。

　　第四阶段：数据处理与分析 (Data Analysis)

　　使用仪器配套软件(如 Biacore Evaluation Software, Scrubber, TraceDrawer)进行分析。

　　数据预处理 (Pre-processing)

　　双参考扣除 (Double Referencing)：

　　减去参考流道(Reference Cell)的信号(去除非特异吸附和 Bulk shift)。

　　减去 0 浓度循环的平均信号(去除系统性漂移)。

　　对齐基线：将各曲线的起始点对齐到 0 RU。

　　模型拟合 (Model Fitting)

　　1:1 Langmuir 结合模型：常用的模型，假设一个配体结合一个分析物，无协同效应。

　　方程：

　　拟合参数：

　　kon​ (或 ka )：结合速率常数 ( M−1s−1 )。

　　koff​ (或 kd​ )：解离速率常数 ( s−1 )。

　　Rmax​ ：z大结合响应值。

　　计算亲和力： KD=koff/kon​ (单位：M)。

　　质量评估指标

　　残差图 (Residuals)：拟合曲线与实验点的差值应随机分布在 0 附近，不应有系统性偏差。

　　Chi² 值：越小越好，通常应小于 Rmax​ 的 1-5%。

　　U 值 (Mass Transport Check)：检查是否存在质量传输限制。

　　Rmax 一致性：不同浓度拟合出的 Rmax​ 应基本一致。

　　第五阶段：常见问题与解决方案 (Troubleshooting)

　　六、总结流程图

　　准备：蛋白纯化/定量 →→ 缓冲液置换/匹配 →→ 浓度梯度稀释。

　　固定：CM5 芯片活化 →→ 偶联配体 →→ 封闭 →→ 制备参考通道。

　　再生筛选：测试再生液，确保可逆结合。

　　动力学运行：低到高浓度进样 →→ 记录结合/解离曲线 →→ 再生。

　　分析：双参考扣除 →→ 1:1 模型拟合 →→ 获取 kon,koff,KDkon​,koff​,KD​ 。

       来源：网络