SPR实验中如何判断样品是否无菌？

　　在SPR(表面等离子体共振)实验的实际操作中，通常不会在每次进样前专门去“检测”样品是否无菌(例如做细菌培养)，因为培养需要24-48小时，而SPR实验通常是实时进行的。

　　1. 核心策略：预防胜于检测(标准操作流程)

　　由于无法实时检测，SPR领域的标准做法是默认所有未过滤的样品都有风险。因此，判断样品合格的唯一标准是是否执行了以下强制步骤：

　　0.22 μmμm 过滤：这是金标准。只要样品和缓冲液经过了0.22 μmμm 滤膜过滤，即可认为达到了SPR所需的“无菌/无颗粒”状态。

　　注意：对于高浓度蛋白，过滤可能会造成损失或堵塞，此时需选用低蛋白吸附的滤膜(如PVDF或再生纤维素材质)，或者采用高速离心(如14,000 rpm, 10-15分钟)取上清作为替代方案，以去除聚集体和微生物。

　　新鲜配制：缓冲液z好现配现用。如果必须保存，应置于4°C且不超过几天，使用前再次过滤。

　　添加防腐剂(可选)：在非活性位点测试中，可在缓冲液中加入0.02%叠氮化钠(NaN3)或0.01%硫柳汞，但需确认不影响蛋白活性且不腐蚀仪器流路(某些仪器严禁叠氮化钠)。

　　2. 运行中的“间接判断”：通过传感器图(Sensorgram)识别污染

　　如果在实验过程中样品实际上含有微生物或大量聚集体，SPR仪器会给出明显的异常信号。你可以通过观察实时曲线来判断样品是否“不干净”：

　　A. 基线漂移与噪音 (Baseline Drift & Noise)

　　现象：在注入样品前，基线不稳定，出现持续的向上或向下漂移，或者高频噪音显著增加。

　　原因：微生物或其碎片在流路或芯片表面非特异性吸附，或者微生物代谢改变了局部折射率。

　　判断：如果空白缓冲液注射(Blank Injection)也出现同样问题，说明流路或缓冲液被污染。

　　B. 不可逆的结合信号 (Irreversible Binding)

　　现象：样品注射结束后，进行再生步骤(Regeneration，通常用低pH或高盐缓冲液冲洗)，信号无法回到初始基线，残留信号很高。

　　原因：细菌、大聚集体或变性蛋白牢固地吸附在芯片表面，普通的再生条件无法洗脱。

　　判断：如果多次循环后残留信号累积，说明样品中存在难以去除的污染物(可能是微生物生物膜)。

　　C. 质量传输限制异常 (Mass Transport Limitation Artifacts)

　　现象：结合曲线的形状怪异，不符合标准的1:1 Langmuir结合模型，且随流速变化出现反常。

　　原因：大颗粒或菌团堵塞了芯片表面的微环境，阻碍了分子的扩散。

　　D. 压力波动 (Pressure Fluctuations)

　　现象：仪器报告压力异常(Pressure Alarm)，或者流速不稳定。

　　原因：这是直接的物理证据，表明有颗粒物(包括菌团)堵塞了毛细管或喷嘴。

　　3. 如果怀疑样品已污染，如何验证?

　　如果你在实验后怀疑样品长菌了(例如样品在室温放了一整天)，可以采取以下事后验证措施(但这不能挽救已经跑坏的芯片)：

　　目视检查：

　　对着强光观察样品管。如果溶液出现浑浊(Turbidity)、絮状物或沉淀，则肯定已污染或蛋白已聚集，绝对不能进样。澄清透明的液体是基本要求。

　　平板涂布法(事后验证)：

　　取少量剩余样品涂布在LB琼脂平板上，37°C培养过夜。如果长出菌落，说明样品已污染。这只能用于复盘，不能用于实验前的即时判断。

　　动态光散射 (DLS)：

　　如果有条件，进样前跑一个DLS。如果检测到粒径分布中出现>100nm甚至微米级的峰，说明存在聚集体或微生物，需重新处理样品。

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