棕色脂肪组织油红染色操作流程

　　棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissue, BAT)的油红O(Oil Red O, OR O)染色是组织学和代谢研究中用于可视化细胞内中性脂质(主要是甘油三酯)的经典方法。

　　与白色脂肪组织(WAT)不同，棕色脂肪细胞含有大量多房性脂滴(Multilocular lipid droplets)和丰富的线粒体。油红O染色能清晰地将这些脂滴染成鲜红色，从而区分棕色脂肪与白色脂肪(单房性大脂滴)，并评估其产热活性状态。

　　标准操作流程(关键步骤与陷阱)

　　由于脂质在常规石蜡包埋过程中会被有机溶剂(二甲苯、酒精)溶解，油红O染色必须在冰冻切片(Frozen Section)上进行。

　　1. 样品制备(关键)

　　取材：快速取出BAT(通常位于小鼠肩胛间、颈部或肾脏周围)，避免挤压。

　　固定：

　　推荐：4% 多聚甲醛(PFA)或10% 中性福尔马林，固定4-24小时(4℃)。

　　注意：固定时间不宜过长，否则脂质可能硬化或流失;严禁使用含酒精的固定液。

　　脱水与包埋：

　　禁止经过梯度酒精和二甲苯透明。

　　正确做法：固定后，用30% 蔗糖溶液脱水沉底(防冰晶)，然后用OCT包埋剂包埋，速冻(液氮或干冰/异戊烷)。

　　切片：

　　厚度：8-10 μm(BAT结构疏松，太薄易碎，太厚背景深)。

　　温度：-20℃至-25℃。

　　贴片：贴于防脱载玻片(如Poly-L-Lysine coated slides)，室温晾干或冷风吹干。

　　2. 染液配制(现配现用)

　　储存液：0.5% 油红O 异丙醇溶液(可长期保存)。

　　工作液：取储存液 : 蒸馏水 = 3 : 2 混合。

　　关键点：混合后静置10-20分钟，必须用滤纸过滤，去除沉淀颗粒。若不过滤，背景会有大量红色沉淀，干扰判断。

　　工作液需在2小时内用完，否则染料会析出失效。

　　3. 染色步骤

　　水洗：PBS或蒸馏水轻洗切片。

　　分化/预处理(可选)：60% 异丙醇浸洗1-2分钟(有助于染料进入脂质，减少非特异吸附)。

　　染色：浸入过滤后的油红O工作液，10-15分钟(避光)。

　　分化：60% 异丙醇快速分化几秒(洗去多余浮色)，直至背景清晰。

　　水洗：蒸馏水冲洗。

　　复染：Mayer苏木素复染细胞核 1-3分钟，水洗返蓝。

　　封片：

　　严禁使用二甲苯透明的树脂封片剂(会溶解脂质和染料)。

　　必须使用水性封片剂(如甘油明胶、Aquamount等)。

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