土壤微生物群落多样性测定步骤

　　土壤微生物群落多样性测定是土壤健康评估、生态功能解析、农业可持续管理及环境修复的核心技术。由于土壤微生物 >99% 不可培养，现代研究主要依赖高通量测序(HTS)结合生物信息学分析。

　　关键步骤

　　1. 样品采集与保存

　　采样策略：

　　多点混合(0–20 cm 表层土)，避免根际干扰(除非专门研究);

　　液氮速冻或 –80℃ 保存(防止 DNA 降解)。

　　避免污染：使用无菌工具，戴手套，剔除植物残体/石块。

　　2. DNA 提取(决定成败的关键!)

　　挑战：土壤含腐殖酸、多酚等 PCR 抑制剂。

　　推荐方法：

　　商业试剂盒：MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit(现 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro);

　　自建 CTAB 法(需加 PVPP 吸附多酚)。

　　质检：

　　Nanodrop：A260/A280 ≈ 1.8，A260/A230 > 2.0;

　　琼脂糖电泳：主带清晰，无拖尾。

　　禁止使用普通血液/组织 DNA 提取试剂盒!

　　3. 标记基因选择

　　推荐：

　　细菌/古菌 → 16S V3–V4 区(Illumina 双端 2×300 bp);

　　真菌 → ITS2 区(变异度高，易扩增)。

　　4. PCR 扩增与建库

　　引物设计：带 Illumina 接头 + barcode(样本索引);

　　PCR 条件：

　　高保真酶(如 Q5®);

　　循环数 ≤25(减少嵌合体);

　　设置 阴性对照(无模板)。

　　纯化：AMPure XP 磁珠(去除引物二聚体);

　　定量：Qubit 荧光计 + Bioanalyzer(确保片段大小 ~450 bp)。

　　5. 高通量测序平台

       来源：网络