巨噬细胞免疫荧光染色实验流程

　　巨噬细胞免疫荧光染色是一种在细胞或组织水平对巨噬细胞进行特异性标记、定位和功能表型分析的重要技术，广泛应用于炎症、感染、肿瘤免疫、动脉粥样硬化及组织修复等研究领域。

　　实验流程(以培养的巨噬细胞或组织切片为例)

　　步骤 1：样本准备

　　细胞样本(如 BMDM、THP-1 诱导巨噬细胞)：

　　接种于盖玻片或 chamber slide

　　刺激(如 LPS/IFN-γ → M1;IL-4/IL-13 → M2)

　　组织样本(如肿瘤、肝脏、脑)：

　　灌注固定 → 取材 → 4% PFA 固定 → 石蜡包埋或冰冻切片(5–10 μm)

　　步骤 2：固定

　　4% 多聚甲醛(PFA)，室温 15–20 分钟

　　PBS 洗 3×5 min

　　避免甲醇/丙酮固定(破坏某些抗原表位)

　　步骤 3：通透(仅需检测胞内抗原时)

　　0.1–0.5% Triton X-100 或 Saponin，室温 10–15 分钟

　　PBS 洗

　　表面标志物(如 CD68、F4/80)可不破膜;iNOS、ARG1 必须破膜

　　步骤 4：封闭

　　5% BSA 或 10% 正常血清(与二抗同源)，室温 1 小时

　　减少非特异性结合

　　步骤 5：一抗孵育

　　稀释一抗于封闭液中(参考抗体说明书)

　　4°C 过夜(或室温 1–2 小时)

　　常用抗体示例：

　　抗-IBA1(Wako, #019-19741)

　　抗-iNOS(Cell Signaling, #13120)

　　抗-CD206(Abcam, ab64693)

　　步骤 6：二抗孵育

　　荧光标记二抗(如 Alexa Fluor 488、594、647)

　　室温避光 1 小时

　　PBS 洗 3×5 min

　　步骤 7：核染与封片

　　DAPI(1 μg/mL)，5 分钟 → 染核

　　抗荧光淬灭封片剂(如 ProLong Gold)封片

　　4°C 避光保存，尽快成像

       来源：网络