分子间亲和力表征技术有哪些？

　　分子间亲和力(Molecular Affinity)是指两个或多个分子之间通过非共价相互作用(如氢键、范德华力、疏水作用、静电作用、π-π堆积等)自发结合的倾向性和强度。其定量表征在药物研发、蛋白质工程、生物传感、材料科学等领域至关重要。

　　主流实验表征技术

　　 1. 表面等离子共振(SPR, Surface Plasmon Resonance)

　　原理：

　　将一个分子(配体)固定在金膜表面，另一分子(分析物)流过;结合引起折射率变化 → 实时监测结合/解离曲线。

　　输出：

　　实时传感图(sensorgram)

　　kon(结合速率), koff(解离速率), KD = koff/kon

　　优点：

　　无需标记

　　动力学+热力学信息

　　灵敏度高(KD 范围：pM–mM)

　　设备：Biacore(Cytiva)、Reichert、Nicoya OpenSPR

　　适用：蛋白-蛋白、蛋白-小分子、DNA-药物等

　　 2. 等温滴定量热法(ITC, Isothermal Titration Calorimetry)

　　原理：

　　向样品池中逐滴加入配体，测量为维持恒温所需的热量变化(ΔH)。

　　输出：

　　KD、ΔH(焓变)、ΔS(熵变)、化学计量比(n)

　　优点：

　　唯一可直接测完整热力学参数的方法

　　无需固定或标记

　　局限：

　　样品消耗量大(μM–mM 浓度)

　　KD 范围：nM–mM(z佳 10−6–10−3 M)

　　设备：MicroCal PEAQ-ITC(Malvern)、TA Instruments

　　 3. 生物层干涉技术(BLI, Bio-Layer Interferometry)

　　原理：

　　类似 SPR，但使用光纤生物传感器探针(如 FortéBio Octet)，通过白光干涉检测结合引起的光程差。

　　优点：

　　无需微流控，操作简便

　　可 96 孔高通量

　　成本低于 SPR

　　缺点：

　　扩散限制影响动力学精度

　　适用：抗体筛选、蛋白互作初筛

　　4. 荧光偏振/各向异性(FP/FA)

　　原理：

　　小分子荧光标记后快速旋转 → 偏振低;与大分子结合后旋转变慢 → 偏振升高。

　　输出：KD(通过竞争结合实验)

　　优点：

　　高通量(384 孔板)

　　快速(分钟级)

　　局限：

　　需荧光标记(可能影响结合)

　　仅适用于小分子-大分子体系

　　应用：药物靶点结合筛选

　　5. 微量热泳动(MST, MicroScale Thermophoresis)

　　原理：

　　分子在温度梯度下发生定向移动(热泳)，结合后运动行为改变 → 荧光检测。

　　优点：

　　样品消耗极少(μL 级，nM 浓度)

　　可在复杂溶液中测试(如细胞裂解液、血清)

　　KD 范围：pM–mM

　　设备：NanoTemper Monolith

　　适用：膜蛋白、RNA-配体、弱相互作用

　　6. 核磁共振(NMR)

　　方法：

　　化学位移扰动(CSP)：观察结合导致的峰位移

　　STD-NMR(饱和转移差)：识别配体与蛋白接触面

　　优点：

　　原子级分辨率

　　可研究动态构象变化

　　局限：

　　灵敏度低，需高浓度(>0.1 mM)

　　数据解析复杂

　　适用：小分子药物片段筛选、弱相互作用(KD ～ mM)

　　7. 计算模拟(辅助手段)

　　分子对接(Docking)：预测结合模式与打分(如 AutoDock, Glide)

　　自由能计算：

　　MM/PBSA、MM/GBSA

　　FEP(自由能微扰)、TI(热力学积分)→ 高精度 KD 预测

　　用途：指导实验设计，解释实验结果

       来源：网络