蛋白质分子量测试方法有哪些？

　　蛋白质分子量测试是生物化学、分子生物学和生物制药领域的基础分析技术，用于验证蛋白表达、纯度、修饰状态及复合物组成。根据测试目的(单体/复合物?天然/变性?是否需高精度?)，需选择合适的方法。下面介绍测试方法：

　　测试方法

　　1. SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)

　　原理：SDS 使蛋白带负电并线性化，迁移率仅与分子量相关;

　　操作：

　　样品 + SDS 上样缓冲液(含 β-巯基乙醇，还原二硫键);

　　与已知 MW 蛋白 Marker 对比;

　　优点：快速、低成本、直观;

　　局限：

　　糖基化/高度碱性蛋白迁移异常;

　　无法区分紧密 MW 差异(如 <5 kDa);

　　典型误差：膜蛋白、胶原蛋白等结构特殊蛋白偏差大。

　　适用：重组蛋白表达验证、Western blot 前处理。

　　2. 质谱法(MS)——精确方法

　　(1)MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)

　　适用：纯化蛋白(>90%)，分子量 5–300 kDa;

　　精度：±0.01%(如 50 kDa 蛋白误差 <5 Da);

　　优势：快速、耐盐、高通量;

　　局限：混合样品需先分离。

　　(2)ESI-MS(电喷雾电离质谱)

　　适用：溶液直接进样，可联用 LC;

　　特点：

　　产生多电荷离子，可测 >100 kDa 蛋白;

　　Native ESI-MS：保留非共价相互作用，测复合物 MW;

　　精度：±0.001–0.01%。

　　关键应用：

　　验证基因序列正确性(实测 MW vs 理论 MW);

　　检测 PTM：

　　磷酸化(+80 Da)、

　　乙酰化(+42 Da)、

　　N-糖基化(+2–3 kDa，呈峰簇)。

　　3. 尺寸排阻色谱(SEC / Gel Filtration)

　　原理：大分子先流出，小分子后流出，通过标准曲线估算 MW;

　　优点：非破坏性，保持天然构象;

　　局限：

　　形状影响(纤维状蛋白偏大);

　　需标准蛋白校准(如 thyroglobulin 670 kDa, γ-globulin 158 kDa);

　　升级版：SEC-MALS(多角度光散射)→ 绝对分子量，无需标准品。

　　适用：抗体聚集检测(单体 vs 二聚体)、蛋白复合物分析。

　　4. 分析型超速离心(AUC)

　　原理：通过沉降速度/平衡，计算分子量与形状;

　　优点：

　　无需固定相或标记;

　　可测溶液中真实状态(包括弱相互作用);

　　缺点：耗时(数小时/样品)、设备昂贵;

　　地位：FDA 推荐用于生物药高级表征。

       来源：网络