transwell悬浮细胞迁移实验

　　1. 实验准备

　　Transwell小室：选择合适孔径(常用5μm或8μm)。

　　趋化因子：根据细胞类型选择，如SDF-1、FBS、特定细胞因子等。

　　细胞：悬浮培养的细胞。

　　培养基：无血清培养基(用于重悬细胞和稀释趋化因子)，含血清的完全培养基(作为阳性对照)。

　　其他：Calcein-AM活细胞染料、结晶紫染液、多聚甲醛、棉签等。

　　2. 实验流程

　　a. 制备下室液体：

　　在下室(即24孔板孔内)加入500-600 μL含有趋化因子的完全培养基或无血清培养基(作为阴性对照)。

　　注意：确保液面与Transwell小室底部接触，但又不会流入上室，以免破坏梯度。

　　b. 制备细胞悬液：

　　收集悬浮细胞，用无血清培养基或PBS清洗2-3次，以去除血清和其他可能影响迁移的因子。

　　用无血清培养基重悬细胞，并调整细胞密度至 0.5-1 × 10^6 cells/mL(具体密度需预实验优化)。

　　c. 接种细胞：

　　取100-200 μL细胞悬液(约含 5-20万个细胞)加入Transwell小室的上室。

　　关键：动作要轻柔，避免产生气泡，否则会阻碍细胞迁移。

　　d. 孵育：

　　将培养板放入37°C、5% CO₂的培养箱中孵育 4-24小时。悬浮细胞迁移通常比贴壁细胞快，孵育时间需要预实验确定，避免时间过长导致所有细胞都迁移下去，或时间过短迁移细胞太少。

　　e. 检测与计数(三种常用方法)

　　方法一： Calcein-AM 荧光标记法(推荐，无损、定量准)

　　孵育结束后，从培养箱中取出Transwell板。

　　在下室培养基中加入适量Calcein-AM工作液(终浓度约1-4 μM)，继续孵育30-60分钟。

　　Calcein-AM能被活细胞摄取，在细胞内酯酶作用下生成绿色荧光的Calcein。

　　直接吸取下室液体，用荧光酶标仪检测荧光强度，强度值与迁移细胞数成正比。

　　方法二： 结晶紫染色法(经典、直观)

　　孵育结束后，用镊子小心取出Transwell小室，吸弃上室内的培养基和未迁移的细胞。

　　用湿润的棉签轻轻擦拭上室膜的内表面，务必彻底擦去未迁移的细胞。这是关键的一步。

　　将小室放入装有预冷甲醇或4%多聚甲醛的孔中，固定细胞10-15分钟。

　　用PBS轻轻冲洗。

　　将小室放入0.1%结晶紫染液中染色15-30分钟。

　　用PBS轻轻漂洗数次，洗去多余染液。

　　在显微镜下随机选择多个视野(例如5个)，拍照并计数迁移到下室面的细胞。

　　方法三： MTT法

　　孵育结束后，将小室转移至新的含有MTT溶液的孔中，继续孵育4小时。

　　小心取出小室，下室中加入DMSO溶解甲臜结晶。

　　用酶标仪测定吸光度(OD570nm)。

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