ki67细胞增殖实验检测方法

　　Ki-67 细胞增殖实验是肿瘤生物学、病理学和药物研发中评估细胞增殖活性的金标准方法之一。Ki-67 是一种核抗原蛋白，在细胞周期的 G₁、S、G₂ 和 M 期表达，但在静止期(G₀)不表达，因此其阳性率可直接反映处于活跃增殖状态的细胞比例。

　　常用的两种方法是：

　　1. 免疫组织化学

　　这是临床应用z广、经典的方法，尤其在肿瘤病理诊断中。

　　原理：利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而在光学显微镜下定位组织细胞中的Ki-67抗原。

　　流程：

　　样本制备：石蜡包埋的组织切片或冰冻切片。

　　脱蜡与水化(石蜡切片)。

　　抗原修复：这是关键步骤，通过加热或酶处理暴露被固定的Ki-67抗原表位。

　　内源性过氧化物酶阻断：减少非特异性背景染色。

　　孵育一抗：加入鼠或兔抗人的Ki-67单克隆抗体。

　　孵育二抗：加入与一抗种属对应的酶标记(如HRP)的二抗。

　　显色：加入DAB等底物，在抗原抗体结合部位产生不溶性的棕色沉淀。

　　复染：用苏木精等染料将全部细胞核染成蓝色，作为背景。

　　封片与观察：在光学显微镜下观察。

　　结果：阳性信号为细胞核呈棕色/黄色，阴性细胞核为蓝色。

　　2. 免疫荧光

　　常用于科研和共聚焦显微镜观察，可以进行多色标记。

　　原理：同样基于抗原抗体反应，但二抗上标记的是荧光素(如FITC-绿色， Cy3-红色)。

　　流程：与IHC类似，但无需酶促显色反应。

　　结果：在荧光显微镜下观察，Ki-67阳性细胞核发出特定颜色的荧光。

　　优势：灵敏度高，可进行多重染色(同时标记其他蛋白)，便于图像分析。

       来源：网络