rna荧光原位杂交实验流程

　　RNA 荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization for RNA, RNA-FISH)是一种高灵敏度、高特异性的分子细胞学技术，用于在完整细胞或组织切片中直接可视化特定RNA分子的空间分布、丰度及亚细胞定位(如核内、胞质、应激颗粒等)。

　　步骤1：样本固定与通透

　　固定：4% 多聚甲醛(PFA)室温10–15分钟，保持RNA完整性与细胞形态;

　　通透：0.1–0.5% Triton X-100 或 70% 乙醇(–20°C)，使探针进入细胞;

　　避免RNase污染：所有试剂需DEPC处理，操作戴手套。

　　步骤2：预杂交(可选)

　　加入含tRNA、鲑鱼精DNA的杂交缓冲液，封闭非特异性结合位点。

　　步骤3：杂交

　　将荧光探针加入杂交缓冲液(含甲酰胺、SSC、dextran sulfate)，覆盖样本;

　　37–42°C 孵育数小时至过夜(甲酰胺降低Tm值，提高特异性)。

　　步骤4：严格洗脱

　　用含甲酰胺的SSC缓冲液梯度洗脱(如2×SSC → 0.2×SSC)，去除非特异结合探针;

　　洗脱温度接近杂交Tm值，确保高信噪比。

　　步骤5：封片与成像

　　DAPI复染细胞核;

　　抗淬灭封片剂(如ProLong Gold)封片;

　　使用共聚焦显微镜或超分辨显微镜(STORM/PALM)采集图像。

       来源：网络