油红o染色检测脂滴水平的实验步骤

　　油红O(Oil Red O, ORO)是一种脂溶性偶氮染料，能特异性地与细胞或组织中的中性脂质(如甘油三酯、胆固醇酯)结合，将其染成鲜红色或橙红色，是目前检测脂滴(lipid droplets)常用、直观的染色方法，广泛应用于脂肪变性、非酒精性脂肪肝(NAFLD)等研究。

　　1. 样品准备与固定

　　细胞：培养的细胞(如肝细胞HepG2、脂肪细胞3T3-L1)爬片或直接培养在孔板中。

　　固定：用4%多聚甲醛室温固定30分钟。这一步是关键，能保持细胞结构并防止脂滴流失。

　　洗涤：用PBS或去离子水轻轻漂洗2-3次，去除固定液。

　　2. 油红O工作液配制(关键步骤)

　　储备液：通常为0.5%的油红O异丙醇溶液(溶解过夜效果更佳)。

　　工作液：临用前配制。将储备液与去离子水按 3:2 的比例混合(例如，6mL储备液 + 4mL水)，静置10-20分钟，然后用滤纸或0.45μm/0.22μm滤器过滤，以去除可能形成的沉淀，获得清澈透明的橙红色工作液。

　　注意：工作液不稳定，需在配制后几小时内使用。

　　3. 染色与脱色

　　染色：向固定好的细胞中加入足量的油红O工作液，确保完全覆盖样品，室温避光孵育30分钟至1小时。

　　脱色/洗涤：用60%异丙醇快速漂洗(不超过30秒)，以去除非特异性背景染色。随后用去离子水或PBS多次漂洗，直至水相清澈。

　　4. 复染与封片

　　复染：使用Mayer's或Harris苏木精复染细胞核约1-2分钟，然后流水冲洗返蓝。

　　封片：对于爬片，可用水性封片剂(如甘油明胶)封片。如果需长期保存，建议使用中性树胶，但需先彻底干燥。

　　5. 显微镜观察

　　立即在光学显微镜下观察。

　　脂滴：鲜红色或橙红色。

　　细胞核：蓝色。

　　背景：应为无色或浅粉色。

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