流式细胞术测定倍性详细操作步骤

　　流式细胞术(Flow Cytometry, FC)是测定生物细胞DNA含量并据此推断其倍性(Ploidy) 的一种快速、准确且高通量的技术。它广泛应用于植物育种、肿瘤学、遗传学和细胞生物学等领域，用于鉴定二倍体(2n)、三倍体(3n)、四倍体(4n)等不同倍性的细胞群体。

　　详细操作步骤

　　1. 样品与标准品准备

　　待测样品: 取新鲜组织(如0.5-1 cm² 植物幼嫩叶片)。

　　标准品 (Crucial!):

　　内标法 (Internal Standard): 将待测样品与已知倍性的标准植物材料(如鸡血红细胞 - 2C=2.5 pg DNA;虹鳟鱼红细胞;或同属的二倍体植物)物理混合后同时处理。这是z准确的方法，可消除染色和仪器波动的影响。

　　外标法 (External Standard): 分别处理待测样品和标准品。准确性稍低，受批次差异影响。

　　常用植物标准：番茄 ('St. Nils' 2C=1.96 pg), 烟草 ('Bel W3' 2C=9.76 pg), 小麦 (2C=30.9 pg)。

　　2. 核提取与染色 (Nuclei Isolation and Staining)

　　使用** chopping method (切碎法)**：

　　切碎: 将待测样品和/或标准品置于预冷的研钵中，加入约1 mL 预冷的核抽提缓冲液 (Nuclei Extraction Buffer)。

　　常用缓冲液: 如LB01, Galbraith's buffer, 或商用试剂盒缓冲液。通常含：

　　离子螯合剂(如柠檬酸钠、MgCl₂)

　　表面活性剂(如Triton X-100)破坏细胞膜

　　DNA酶抑制剂

　　调节pH和渗透压

　　快速切碎: 用锋利的刀片在2-3分钟内将组织切碎，释放细胞核。

　　过滤: 将匀浆液通过50-100 μm尼龙网过滤，去除碎片，收集滤液(含游离细胞核)。

　　染色: 向滤液中加入DNA荧光染料(如碘化丙啶 PI, 50 μg/mL)，避光孵育5-15分钟。

　　PI: 常用，红色荧光(Ex/Em ~535/617 nm)，需结合RNase A(20-50 μg/mL)处理以去除RNA干扰。

　　DAPI: 蓝色荧光(Ex/Em ~358/461 nm)，可穿透完整细胞膜，常用于活细胞染色。

　　(可选) 调整浓度: 用缓冲液调整细胞核悬液浓度至适合上机(通常50-100个细胞/秒)。

　　3. 流式细胞仪检测

　　开机校准: 打开仪器，用标准微球校准光路和荧光检测系统。

　　上样: 将样品管放入自动进样器或手动进样。

　　参数设置:

　　FS (Forward Scatter): 反映细胞/核大小。

　　SS (Side Scatter): 反映细胞/核内部复杂度。

　　FL (Fluorescence Channel): 根据染料选择(如PI用FL2或FL3通道)。

　　获取数据: 收集足够的事件数(通常5,000-10,000个细胞核)，重点关注G₀/G₁期的峰值。

　　4. 数据分析与倍性判定

　　绘制直方图: 以荧光强度(DNA含量)为横坐标，细胞/核数量为纵坐标，生成DNA含量分布直方图。

　　识别峰: 正常细胞周期中：

　　G₀/G₁期峰: 单倍DNA含量(2C for diploid)。

　　G₂/M期峰: 双倍DNA含量(4C for diploid)，高度约为G₀/G₁峰的一半(因处于此阶段的细胞少)。

　　计算DNA指数 (DNA Index, DI): DI = (待测样本 G₀/G₁ 峰的平均荧光强度) / (标准品 G₀/G₁ 峰的平均荧光强度)

　　判定倍性:

　　若标准品为二倍体(2n)，则：

　　DI ≈ 1.0 → 待测样本为二倍体 (2n)

　　DI ≈ 1.5 → 待测样本为三倍体 (3n)

　　DI ≈ 2.0 → 待测样本为四倍体 (4n)

　　以此类推。

　　对于多倍体系列，DI值应呈整数倍或简单分数倍关系。

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