蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理

　　蛋白质免疫印迹(Western Blot, WB)通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，依据分子量差异将混合蛋白转移到固相载体(如PVDF膜或硝酸纤维素膜)上，利用抗体特异性结合目标蛋白，并通过标记二抗显色检测目标蛋白的存在及表达量‌。其核心步骤包括：

　　‌电泳分离‌：SDS使蛋白质变性并均匀负电荷化，电泳迁移率仅取决于分子量。

　　‌转膜‌：将凝胶中的蛋白转移至膜上，保持抗原活性。

　　‌免疫检测‌：一抗结合目标蛋白，二抗标记酶或荧光团，通过化学发光或显色反应可视化‌。

　　实验步骤详解

　　1. ‌样本制备‌

　　‌细胞/组织处理‌：裂解液(如RIPA)提取蛋白，加入蛋白酶抑制剂防止降解。

　　‌定量‌：BCA法测定蛋白浓度，确保上样量一致。

　　2. ‌SDS-PAGE电泳‌

　　‌凝胶配置‌：分离胶(10%)和浓缩胶(4%)按需配制或使用预制胶。

　　‌电泳参数‌：浓缩胶80V，分离胶120V，直至染料前沿跑出凝胶。

　　3. ‌转膜与封闭‌

　　‌转膜‌：湿转或半干转法将蛋白转移至PVDF膜(需甲醇活化)或NC膜。

　　‌封闭‌：5%脱脂奶粉或BSA封闭非特异性结合位点，降低背景‌。

　　4. ‌抗体杂交与检测‌

　　‌一抗孵育‌：特异性结合目标蛋白，4℃过夜或室温1-2小时。

　　‌二抗孵育‌：酶标二抗(如HRP标记)结合一抗，TBST洗膜去除非特异性结合‌。

　　‌显影‌：化学发光(ECL)或底物显色，通过成像系统分析条带。

       来源：网络