ki67检测细胞增殖流式详细的实验流程、关键步骤及注意事项

　　Ki67是一种核蛋白，与细胞增殖密切相关(存在于G1、S、G2和M期，静止期G0细胞不表达)，通过流式细胞术检测Ki67阳性细胞比例可量化细胞增殖活性。

　　一、实验流程概述

　　样本准备 → 固定 → 透膜 → 抗体染色 → 流式检测 → 数据分析

　　二、详细操作步骤

　　1. 样本制备

　　细胞类型：悬浮细胞直接收集;贴壁细胞需胰酶消化(避免过度消化损伤膜表面蛋白)。

　　细胞数量：建议每样本≥1×10⁶细胞，确保统计学可靠性。

　　对照组设置：

　　阴性对照：同型IgG抗体(匹配Ki67抗体种属和亚型);

　　阳性对照：已知高增殖细胞(如激活的淋巴细胞或肿瘤细胞系)。

　　2. 固定与透膜

　　乙醇固定可同时透膜，若使用PFA需额外透膜处理;

　　透膜时间过长可能导致细胞碎片增多，需优化。

　　3. 抗体染色

　　抗体选择：

　　推荐抗人Ki67抗体(如BD Pharmingen 克隆B56，适用种属：人、猴);

　　种属匹配二抗(如兔抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488)。

　　染色步骤：

　　封闭：1% BSA/PBS，室温30分钟(减少非特异性结合);

　　一抗孵育：Ki67抗体(稀释比例1:100~1:200)，4℃避光1小时;

　　洗涤：PBS洗3次，离心300g×5分钟;

　　二抗孵育(间接法需此步)：避光室温30分钟;

　　再次洗涤，重悬于PBS(含1% BSA)。

　　4. 流式检测

　　仪器设置：

　　激发/发射波长：根据荧光染料选择(如Alexa Fluor 488→Ex 488 nm/Em 530 nm);

　　阈值设定：FSC/SSC排除碎片，调节电压使阴性群位于10¹~10²通道。

　　数据采集：收集≥10,000个细胞事件，保存FCS格式文件。

　　5. 数据分析

　　软件：FlowJo、FCS Express或BD FACSDiva。

　　门控策略：

　　FSC-A vs SSC-A：圈定活细胞群，排除碎片;

　　单细胞门：FSC-H vs FSC-A去除粘连体;

　　荧光通道：对比阴性对照，设门区分Ki67⁺(增殖细胞)与Ki67⁻(静止细胞)。

　　结果输出：Ki67阳性细胞百分比(%)、平均荧光强度(MFI)。

　　三、关键注意事项与优化

　　1. 避免假阳性/假阴性

　　2. 多色Panel设计

　　兼容标记：

　　细胞周期：与DNA染料(如PI、7-AAD)联用，需先固定透膜后染色;

　　表面标记：先染表面抗原(如CD3/CD19)，再固定透膜染Ki67;

　　凋亡检测：避免与Annexin V(需完整膜结构)同时使用。

　　3. 特殊样本处理

　　组织样本：

　　制备单细胞悬液(机械分散+胶原酶消化);

　　红细胞裂解(ACK缓冲液：155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA)。

　　冰冻细胞：固定后可用含10% DMSO的冻存液-80℃保存，避免反复冻融。

　　四、应用场景与数据解读

　　肿瘤研究：Ki67⁺比例>20%提示高增殖性(如侵袭性淋巴瘤);

　　免疫学：评估T/B细胞活化状态(如疫苗免疫后增殖水平);

　　药物筛选：对比处理组与对照组Ki67⁺比例，计算抑制率。

　　五、常见问题FAQ

　　Q1: Ki67与BrdU检测有何区别?

　　Ki67：标记所有活跃周期细胞(无需预标记);

　　BrdU：需细胞摄入胸腺嘧啶类似物，仅标记S期细胞。

　　Q2: 能否与细胞活力染料(如PI)联用?

　　可以，但需注意PI与红色荧光通道冲突(建议选用绿色Ki67抗体+PI在FL2/FL3检测)。

　　Q3: 乙醇固定后细胞形态变化影响FSC/SSC?

　　是，乙醇固定会缩小细胞体积(FSC降低)，需重新调整电压和阈值。

       来源：网络