细胞内细胞因子染色法实验技术原理与流程

　　1. 实验设计关键步骤

　　细胞刺激与阻断：

　　使用布雷菲德菌素A(BFA)或莫能菌素抑z细胞因子分泌，促进胞内累积。

　　抗原特异性刺激：HIV Gag肽库(5 μg/mL)激活CD8+ T细胞。

　　细胞表面染色：标记CD3、CD4、CD8等表型抗体(避光，4℃孵育30分钟)。

　　固定与破膜：

　　固定液(4%多聚甲醛)维持细胞形态。

　　破膜剂(0.1% Triton X-100或商品化试剂盒)穿透细胞膜。

　　胞内染色：加入IFN-γ、IL-2等荧光标记抗体(室温避光孵育1小时)。

　　2. 流式细胞术参数设置

　　电压与补偿：单阳对照调节PMT电压，补偿矩阵消除荧光溢出。

　　设门策略：

　　排除死细胞(DAPI或Fixable Viability Dye)。

　　圈选CD3+CD4+或CD3+CD8+群体，分析细胞因子双阳性细胞比例。

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