过氧化氢酶（CAT）活性测定方法

　　一、紫外分光光度法(推荐方法)

　　1、实验原理

　　CAT催化H₂O₂分解，导致其在240nm处吸光度下降，通过测定吸光值变化速率计算酶活性。

　　2、试剂准备

　　50mM PBS缓冲液(pH7.0)

　　30mM H₂O₂(现配现用)

　　酶提取液(含1mM EDTA的PBS)

　　3、操作步骤

　　样品处理：

　　取0.2g样品液氮研磨

　　加入2mL预冷提取液

　　4℃ 12,000g离心15min

　　上清液为酶提取液

　　反应体系(1mL)：

　　3、测定：

　　立即混匀

　　240nm处每30s记录吸光值

　　连续测定3min

　　数据处理

　　CAT活性(U/gFW)=ΔA240×V总/(ε×d×m×V酶)

　　其中：

　　ΔA240：每分钟吸光度变化值

　　ε=40M⁻¹cm⁻¹(H₂O₂摩尔消光系数)

　　d=1cm(比色皿光径)

　　m=样品鲜重(g)

　　V总=1mL

　　V酶=20μL

　　二、高锰酸钾滴定法

　　实验流程

　　1、反应体系：

　　5mL 0.1M H₂O₂

　　1mL酶液

　　25℃反应5min

　　2、终止反应：

　　加入5mL 10% H₂SO₄

　　3、滴定：

　　用0.01M KMnO₄滴定至淡粉色

　　结果计算

　　CAT活性(U/g)=(V空白-V样品)×C×5/(t×m)

　　C：KMnO₄浓度(mol/L)

　　t：反应时间(min)

　　三、氧电极法

　　操作要点

　　1、仪器校准：

　　无氧水(Na₂SO₃饱和)

　　空气饱和水

　　2、反应体系(2mL)：

　　PBS缓冲液

　　20μL酶液

　　20μL 30mM H₂O₂

　　结果计算

　　CAT活性(U/g)=Δ[O₂]×V/m

　　四、注意事项

　　1、关键控制点：

　　H₂O₂需现配现用

　　酶提取全程保持4℃

　　反应温度控制在25±0.5℃

　　2、常见问题：

　　吸光度变化不明显：可适当增加酶液用量

　　反应速度过快：稀释酶液或降低H₂O₂浓度

　　3、方法选择建议：

　　五、应用实例

　　以小麦叶片CAT测定为例：

　　取样：取第3片完全展开叶

　　提取：按1:10(w/v)加入提取液

　　测定：紫外分光光度法

　　典型结果：

　　正常生长：15-20U/gFW

　　干旱胁迫：25-35U/gFW

　　注：1U定义为每分钟分解1μmol H₂O₂所需的酶量。建议每个样品设置3次重复，数据取平均值±标准差。

       来源：网络