蔗糖合酶活性的测定方法

　　蔗糖合酶(Sucrose Synthase, SS)活性的测定通常基于其催化蔗糖分解为果糖和UDP-葡萄糖的反应。以下是常用的测定方法：

　　1. 原理

　　蔗糖合酶催化以下反应：

      通过测定反应产物(果糖或UDP-葡萄糖)的生成量，可以计算蔗糖合酶的活性。

　　2. 仪器与试剂

　　仪器

　　分光光度计：用于测定吸光度。

　　恒温水浴：控制反应温度(通常为30°C或37°C)。

　　离心机：用于分离反应液。

　　移液管：1 mL、5 mL、10 mL。

　　试管：用于反应和测定。

　　试剂

　　蔗糖：底物。

　　UDP：底物。

　　果糖标准溶液：用于绘制标准曲线。

　　DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)：用于测定还原糖。

　　缓冲液(pH 7.0)：如Tris-HCl或磷酸缓冲液。

　　酶提取液：从样品中提取蔗糖合酶。

　　3. 测定步骤

　　3.1 酶提取

　　样品处理：

　　取植物组织(如叶片或根)，洗净并切碎。

　　加入预冷的提取缓冲液(如50 mM Tris-HCl, pH 7.0)，匀浆。

　　离心：

　　将匀浆液在4°C下离心(10,000 g，15分钟)。

　　取上清液作为酶提取液。

　　3.2 酶反应

　　反应体系：

　　在试管中加入以下成分：

　　0.5 mL酶提取液

　　0.5 mL 100 mM蔗糖溶液

　　0.5 mL 10 mM UDP溶液

　　1.5 mL缓冲液(pH 7.0)

　　反应：

　　将试管放入30°C或37°C恒温水浴中，反应30分钟。

　　终止反应：

　　加入2 mL DNS试剂，煮沸5分钟，终止反应并显色。

　　冷却至室温。

　　3.3 测定

　　离心：

　　将反应液离心(3000 rpm，10分钟)，取上清液。

　　测定吸光度：

　　在540 nm波长下测定上清液的吸光度。

　　4. 标准曲线绘制

　　配制标准系列：

　　分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL果糖标准溶液，加入试管中。

　　分别加入1 mL缓冲液和1 mL DNS试剂。

　　反应与测定：

　　煮沸5分钟，冷却至室温。

　　在540 nm波长下测定吸光度。

　　绘制标准曲线：

　　以果糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

　　5. 计算

　　计算果糖浓度：

　　根据样品吸光度，从标准曲线中查得果糖浓度 CC(mg/mL)。

　　计算酶活性：

　　其中：

　　CC：果糖浓度(mg/mL)。

　　VV：反应液体积(mL)。

　　DD：稀释倍数。

　　WW：样品重量(g)。

　　TT：反应时间(h)。

　　6. 注意事项

　　样品处理：确保样品新鲜，避免酶活性损失。

　　反应温度：严格控制反应温度，避免影响酶活性。

　　DNS试剂：DNS试剂需现配现用，避免失效。

　　重复测定：每个样品至少重复测定三次，取平均值。

　　空白对照：每次测定需设置空白对照(用蒸馏水代替酶提取液)。

　　7. 参考标准

　　GB/T 35882：植物酶活性测定方法。

　　ISO 5725：测定方法的精密度和准确度。

       来源：网络