细胞透射电镜拍线粒体步骤和注意事项

　　使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)拍摄细胞中的线粒体是一项精细且技术要求较高的实验操作。以下是详细的步骤和注意事项，帮助你成功地进行这项工作。

　　实验准备

　　材料与设备

　　样品：含有线粒体的细胞或组织。

　　试剂：

　　缓冲液(如磷酸盐缓冲液，PBS)

　　固定剂(如戊二醛、多聚甲醛)

　　脱水剂(乙醇系列)

　　渗透剂(如丙酮)

　　包埋剂(如环氧树脂)

　　染色剂(如醋酸铀、柠檬酸铅)

　　仪器：

　　超薄切片机(Ultramicrotome)

　　透射电子显微镜(TEM)

　　离心机

　　冷冻超薄切片装置(可选)

　　样品处理步骤

　　1. 取样与固定

　　取样：迅速从培养皿或组织中取出所需的细胞或组织样本，尽量保持其完整性。

　　预固定：将样本置于4°C预冷的固定液(如2.5%戊二醛+0.1M PBS，pH 7.4)中固定1-2小时。

　　后固定：用1%锇酸溶液在4°C下固定1-2小时，进一步增强对比度。

　　2. 脱水与渗透

　　脱水：依次使用30%、50%、70%、80%、90%和1百%的乙醇进行梯度脱水，每个浓度处理10-15分钟。

　　渗透：用丙酮逐渐替代乙醇，z后用包埋剂(如Spurr树脂)逐步替换丙酮。

　　3. 包埋与聚合

　　包埋：将处理好的样本放入模具中，加入新鲜配制的包埋剂，确保样本完全浸没。

　　聚合：在60°C烘箱中聚合过夜，使树脂充分硬化。

　　4. 切片与捞片

　　切片：使用超薄切片机将包埋块切成约60-90纳米厚的超薄切片。

　　捞片：用铜网捞起切片，并放置于滤纸上吸去多余液体。

　　5. 染色

　　负染：可选择性地对某些样品进行负染处理，以提高图像对比度。

　　重金属染色：使用醋酸铀和柠檬酸铅进行双染，通常分别染色10-15分钟。

　　透射电镜观察

　　1. 样品装载

　　将染色后的铜网放置在专用的样品台上，确保其稳固且无气泡残留。

　　2. 调整与观察

　　调整参数：根据样品特性调整加速电压、放大倍数、聚焦等参数。

　　观察与记录：找到感兴趣的区域(如线粒体)，调整至最佳成像条件并拍照记录。

　　注意事项

　　避免污染：在整个过程中要特别注意防止灰尘和其他杂质污染样品。

　　操作精细：超薄切片过程需要极高的耐心和技巧，建议在有经验的技术人员指导下进行。

　　安全防护：部分试剂具有毒性，操作时应佩戴手套、护目镜，并在通风良好的环境中进行。

       来源：网络