免疫组化染色送样要求

　　1.包埋：石蜡包埋、OTC包埋。

　　(1)标本要求：已固定在4%多聚甲醛中的动物组织，或已固定在FAA中的植物组织。

　　(2)送样要求：

　　a. 动物组织：处死动物后立即取材，生理盐水冲洗表面，4%的多聚甲醛固定，一般组织固定48h左右进行包埋z好，大小不超过1cm*1cm*0.5cm，装组织的管子一定要比组织大，固定液是样品体积的5倍以上，以保证充分固定，封口膜封好避免运输过程中固定液洒出。

　　注：常温或少量冰袋运输。

　　2.切片：石蜡切片、冰冻切片。

　　(1)标本要求：已包埋的动物。

　　(2)送样要求：

　　a. 石蜡包埋的组织：冰袋运输。

　　b. OTC包埋的组织：干冰运输。

　　3.染色:

　　a.石蜡切片：

　　1)脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化。依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度(100%、95%、80%、70%)各2min，水洗5min(不要直接对着切片冲洗)。PBS洗3次，3 min/次。

　　2)细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液(40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2)浸润切片30min(RT 避光)，降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

　　3)抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原修复。常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。(酶修复法也是可以的)。PBS洗3次，3 min/次。

　　4)血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。用油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

　　5)孵育一抗：对圈内的组织滴加稀释好的一抗，4℃过夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。

　　6)孵育二抗：对圈内的组织滴加稀释好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

　　7)切片显色：用DAB显色10min，显色液z好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。

　　8)复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。脱水时，乙醇梯度(由低至高：50%、70%、95%、100%)各2min。二甲苯5min使切片透明化，z后加入中性树胶封片(一般封片后z好立即拍照，若不能及时拍照，可用指甲油封固并保持好避光和湿度)。

　　b. 冰冻切片

　　1)固定冷冻切片组织：立即将粘附冷冻切片组织载玻片放入固定液中固定30s-1min。

　　2)固定后清洗：切片固定后，将载玻片取出，放入自来水中轻轻晃动，完全除去载玻片上的固定液及OCT包埋剂。

　　3)血清封闭：去除组织残留固定液及包埋剂后，用免疫组化油笔圈定待测组织区域，并在圈定区域内滴加适量封闭剂孵育 20 s。然后用TBS清洗液洗涤玻片 30 s。

　　4)孵育一抗：去除载玻片上多余的清洗液，对圈内的组织滴加稀释好的一抗，4℃过夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。

　　5)孵育二抗：对圈内的组织滴加稀释好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

　　6)滴加DAB：去除载玻片上多余的清洗液，在油笔圈定区域内滴加适量DAB显色液，并孵育 90 s左右。然后用纯水冲洗 10 s。

　　7)复染及封片：滴加适量苏木素复染液，孵育 10 s左右，然后用纯水冲洗 10 s。z后进行脱水封片

　　4.拍照：普通荧光拍照、全息数字扫描。

       来源：网络