组织切片染色步骤注意事项

　　免疫荧光法适合于冰冻切片染色，因为这种切片通常保存抗原的能力更好。若选择石蜡切片，则应优先考虑免疫酶法等染色技术。

　　使用荧光标记的商品抗体进行染色前，应该先确定抗体的效力，找到适合的稀释倍数后再进行成批染色。一般来说，当阳性物质呈明亮荧光而背景较暗时的稀释倍数是最适合的。高稀释倍数的荧光抗体可减少非特异性染色，使染色结果更具特异性，但若稀释倍数过高则可能导致假阴性结果的出现。

　　荧光抗体稀释度较低时，有利于观察结果，但可能会导致出现非特异性的染色，甚至产生假阳性结果。

　　除去非特异性荧光。要去除非特异性荧光有很多种方法。通常情况下，冰冻切片的非特异性荧光会更明显，而石蜡切片的非特异性荧光相对较轻。常见的处理方法包括：

　　先使用非免疫血清(如10%牛血清)处理组织切片，然后进行荧光染色。

　　通过小鼠相应组织的干粉吸收荧光抗体中的非特异性成份。

　　确定适当的稀释比例和切片厚度。

　　选择具有高特异性和高效力的荧光抗体。

　　(清洗必须要彻底。每一步骤都需要使用蒸馏水或缓冲液进行清洗，以清除残留在切片中的试剂，以达到特异着色的目的。在清洗时，无论是冲洗还是振荡清洗，都应遵循基本原则，确保清洗彻底，或者说充分稀释上一步骤中的试剂，使其浓度降至最低。

　　只要有充足的时间，建议使用静置廷长的洗涤时间，以防止脱片，这是一个较好的方法。洗涤液的PH值应该在7.2~7.4之间，太高或太低都不利于染色过程，特别是在偏碱性的PH值条件下。

　　孵化时间和温度。通常最佳的时间和温度是37℃，持续20至30分钟。当然，这也与抗体的强度、组织抗原的含量和位置、切片的厚度等因素有关。

       来源：网络